硫氧還蛋白過氧化物酶（TPX）測試盒

硫氧還蛋白過氧化物酶（TPX）測試盒

微量法100T/96S

注意：正式測定之前選擇2-3個(ge) 預期差異大的樣本做預測定。

測定意義(yi) ：

TPX屬於(yu) 過氧化物酶家族，在體(ti) 內(nei) 主要通過還原過氧化氫和一些氫過氧化物來實現抗氧化作用，功能與(yu) GPX類似，也是穀胱甘肽氧化還原循環關(guan) 鍵酶之一。TPX普遍存在於(yu) 各種生物體(ti) 內(nei) ，如酵母、植物、動物、原生動物、寄生蟲、細菌和古細菌，在進化上高度保守。TPX與(yu) 細胞增殖、分化、細胞凋亡及腫瘤發生調控密切相關(guan) 。TPX的主要功能包括細胞脫毒、抗氧化和調節由過氧化氫介導的信號轉導和免疫反應。

測定原理：

TPX催化H2O2氧化二硫蘇糖醇（DTT），H2O2的吸收波長為(wei) 240nm，通過測定240nm吸光度的下降速率，即可計算出TPX活性。

自備儀(yi) 器和用品:

低溫離心機、水浴鍋、可調節移液器、紫外分光光度計/酶標儀(yi) 、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、和蒸餾水

試劑組成和配製:

試劑一：液體(ti) 120mL×1瓶，室溫保存。

試劑二：液體(ti) 20mL×1瓶，- 20℃保存。

試劑三：液體(ti) 2mL×1支，4℃。

粗酶液提取：

組織：按照組織質量（g）：試劑一體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。

細菌、真菌：按照細胞數量（104個(ge) ）：試劑一體(ti) 積（mL）為(wei) 500~1000：1的比例（建議500萬(wan) 細胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然後8000g，4℃，離心10min，取上清置於(yu) 冰上待測。

血清等液體(ti) ：直接測定。

TPX測定操作：

取微量石英比色皿或96孔板，加入4 μL上清液，180 μL試劑二，16 μL試劑三，迅速混勻後於(yu) 240 nm測定10s和130s吸光度，記為(wei) A1和A2。

TPX活性計算公式：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義(yi) ：25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分鍾催化1nmol H2O2降解為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

TPX（nmol/min /mg prot）=(A1－A2)÷ε÷d×V反總÷（Cpr×V樣）÷T

=573×(A1－A2)÷Cpr

(2). 按樣本質量計算

活性單位定義(yi) ：25℃或者37℃中，每克樣本每分鍾催化1nmol H2O2降解為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

TPX活性（nmol/min/g 鮮重）=(A1－A2)÷ε÷d×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=573×(A1－A2)÷W

（3）按細胞數量計算

活性單位定義(yi) ：25℃或者37℃中，每104個(ge) 細胞每分鍾催化1nmol H2O2降解為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

TPX活性（nmol/min/104 cell）=(A1－A2)÷ε÷d×V反總÷(細胞數量×V樣÷V樣總)÷T

=573×(A1－A2)÷細胞數量

（4）按液體(ti) 體(ti) 積計算

活性單位定義(yi) ：25℃或者37℃中，每毫升液體(ti) 每分鍾催化1nmol H2O2降解為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

TPX活性（nmol/min /mL）=(A1－A2)÷ε÷d×V反總÷V樣÷T

=573×(A1－A2)

ε：H2O2的摩爾消光係數，43600 L/mol/cm=0.0436 L/μmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積（L），200 μ L=2×10-4 L；Cpr：上清液蛋白質濃度（mg/mL）；W ：樣品質量；V樣：加入反應體(ti) 係中上清液體(ti) 積（mL），4 μL=4×10-3 mL；V樣總：提取液體(ti) 積，1 mL；T：反應時間（min），2min。

b.使用96孔板測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義(yi) ：25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分鍾催化1nmol H2O2降解為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

TPX活性（nmol/min /mg prot）=(A1－A2)÷ε÷d×V反總÷（Cpr×V樣）÷T

=1146×(A1－A2)÷Cpr

(2). 按樣本質量計算

活性單位定義(yi) ：25℃或者37℃中，每克樣本每分鍾催化1nmol H2O2降解為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

TPX活性（nmol/min/g 鮮重）=(A1－A2)÷ε÷d×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=1146×(A1－A2)÷W

（3）按細胞數量計算

活性單位定義(yi) ：25℃或者37℃中，每104個(ge) 細胞每分鍾催化1nmol H2O2降解為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

TPX活性（nmol/min/104 cell）=(A1－A2)÷ε÷d×V反總÷(細胞數量×V樣÷V樣總)÷T

=1146×(A1－A2)÷細胞數量

（4）按液體(ti) 體(ti) 積計算

活性單位定義(yi) ：25℃或者37℃中，每毫升液體(ti) 每分鍾催化1nmol H2O2降解為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

TPX活性（nmol/min /mL）=(A1－A2)÷ε÷d×V反總÷V樣÷T

=1146×(A1－A2)

ε：H2O2的摩爾消光係數，43600 L/mol/cm=0.0436 L/μmol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積（L），200 μL=2×10-4 L；Cpr：上清液蛋白質濃度（mg/mL）；W ：樣品質量；V樣：加入反應體(ti) 係中上清液體(ti) 積（mL），4 μ L=4×10-3 mL；V樣總：提取液體(ti) 積，1 mL；T：反應時間（min），2min。

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