硝酸還原酶(NR)測試盒

硝酸還原酶(NR)測試盒

微量法 100管/48樣

正式測定前務必取2-3個(ge) 預期差異較大的樣本做預測定

測定意義(yi)

NR（ EC 1.7.1.3）廣泛存在於(yu) 植物中，是植物硝態氮轉化為(wei) 氨態氮的關(guan) 鍵酶，也是誘導酶，對作物的產(chan) 量和品質有影響。

測定原理

NR催化硝酸鹽還原為(wei) 亞(ya) 硝酸鹽，NO3ˉ +NADH+H＋→ NO2ˉ +NAD＋ +H 2 O；產(chan) 生的亞(ya) 硝酸鹽能夠在酸性條件下，與(yu) 對–氨基苯磺酸及 α - 萘胺定量生成紅色偶氮化合物；生成的紅色偶氮化合物在 540 nm 有最大吸收峰，可用分光光度法測定。

需自備的儀(yi) 器和用品

可見分光光度計/酶標儀(yi) 、水浴鍋、台式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配製

誘導劑儲(chu) 備液：液體(ti) 50mL×1瓶，4℃保存。

提取液：液體(ti) 60mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體(ti) 10mL×1瓶，-20℃保存。

試劑二：液體(ti) 5mL×1瓶，-20℃保存；

試劑三：液體(ti) 6mL×1瓶，4℃保存（如出現結晶析出，60℃-90℃水浴溶解後使用）；

試劑四：液體(ti) 6mL×1瓶，4℃保存。

試劑五：標準儲(chu) 備液1mL，-20℃保存。

誘導劑應用液的配製：用時將誘導劑儲(chu) 備液稀釋10倍，即取10mL誘導劑儲(chu) 備液加90mL蒸餾水，充分混勻。

0.1umol/mL的標準液的配製：用時將試劑五稀釋100倍，即取 0.1ml試劑五加9.9mL蒸餾水，充分混勻。

樣本前處理

動植物組織樣品的前處理:

（1）取適量誘導劑於(yu) 燒杯中，將新鮮標本洗淨，濾紙吸幹，放入誘導劑應用液中（淹沒即可），浸泡2h，取出樣本，濾紙吸幹。

（2）按照組織質量（g）：提取液體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

注意：

1. 建議使用新鮮沒有冷凍過的樣本。

2. 一般不要誘導處理，預測定結果沒有活性（A測定≤A對照管）則需要誘導處理。

細菌或培養(yang) 細胞的前處理：

先收集細菌或細胞到離心管內(nei) ，離心後棄上清；按照細菌或細胞數量（104個(ge) ）：提取液體(ti) 積（mL）為(wei) 500~1000：1的比例（建議500萬(wan) 細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重複30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟

1、分光光度計或酶標儀(yi) 預熱30min以上，調節波長至540nm，蒸餾水調零。

2、樣本測定（在EP管或96孔板中加入下列試劑）

混勻後，37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）反應30min

混勻，25℃室溫顯色20min，540nm處比色

注意：1、標準管和空白管隻需測一次，每個(ge) 測定管設一個(ge) 對照管。

2、誘導處理後的樣本對照管中試劑二改成加25μL蒸餾水。

NR活性計算：

（1）按樣本鮮重計算：

單位定義(yi) ：每小時每g鮮重樣品中催化產(chan) 生 1μmol NO2ˉ的量為(wei) 一個(ge) NR活力單位。

NR（μmol/h/g 鮮重）= (C標準管×V1)×（A測定管-A對照管）÷（A標準管-A空白管）÷(W×V1÷V2)÷T=0.2×（A測定管-A對照管）÷（A標準管-A空白管）÷W

（2）按樣本蛋白濃度計算：

單位定義(yi) ：每小時每mg組織蛋白催化產(chan) 生 1μmol NO2ˉ的量為(wei) 一個(ge) NR活力單位。

NR（μmol/h/mg prot）=(C標準管×V1)×（A測定管-A對照管）÷（A標準管-A空白管）÷(V1×Cpr)÷T=0.2×（A測定管-A對照管）÷（A標準管-A空白管）÷Cpr

C標準管：標準管濃度，0.1μmol/mL；V1：加入樣本體(ti) 積：0.02mL；V2：加入提取液體(ti) 積，1mL；T：反應時間，0.5h；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g。

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