硫氧還蛋白氧化還原酶（TrxR）測試盒

硫氧還蛋白氧化還原酶（TrxR）測試盒

微量法100T/96S

注意：正式測定之前選擇2-3個(ge) 預期差異大的樣本做預測定。

測定意義(yi) ：

TrxR是一種NADPH依賴的包含FAD結構域的二聚體(ti) 硒酶，屬於(yu) 吡啶核苷酸-二硫化物氧化還原酶家族成員，與(yu) 硫氧還蛋白以及NADPH共同構成了硫氧還蛋白係統。TrxR與(yu) GR活性類似，催化GSSG還原生成GSH，是穀胱甘肽氧化還原循環關(guan) 鍵酶之一。

測定原理：

TrxR催化NADPH還原DTNB生成TNB和NADP+，TNB在412 nm有特征吸收峰，通過測定412nm波長處TNB的增加速率，即可計算TrxR活性。

自備儀(yi) 器和用品：

低溫離心機、可調節移液器、可見分光光度計/酶標儀(yi) 、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸餾水。

試劑組成和配製：

試劑一：液體(ti) 120mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體(ti) 2mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑三：粉劑×1管，4℃保存。臨(lin) 用前加入2mL蒸餾水溶解。

粗酶液提取：

組織：按照組織質量（g）：試劑一體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。

細菌、真菌：按照細胞數量（104個(ge) ）：試劑一體(ti) 積（mL）為(wei) 500~1000：1的比例（建議500萬(wan) 細胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然後8000g，4℃，離心10min，取上清置於(yu) 冰上待測。

3.  血清等液體(ti) ：直接測定。

TrxR測定操作：

1. 分光光度計/酶標儀(yi) 預熱30 min，調節波長到412nm，用蒸餾水調零。

2. 試劑一在25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動物）預熱30min。

3. 空白管：取微量玻璃比色皿或96孔板，加入20μL試劑二，20μL試劑三，160μL試劑一，迅速混勻後於(yu) 412 nm測定10 s和310 s吸光度，記為(wei) A1和A2。△A空白管=A2-A1。

4. 測定管：取微量玻璃比色皿或96孔板，加入20μL試劑二，20μL試劑三，140μL試劑一，20μL上清液，迅速混勻後於(yu) 412 nm測定10 s和310 s吸光度，記為(wei) A3和A4。△A測定管=A4-A3。

注意：空白管隻需測定一次。

TrxR活性計算公式：

(1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義(yi) ：在25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分鍾催化1nmol DTNB還原為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

TrxR（nmol/min /mg prot）=（△A測定管-△A空白管）÷ε÷d×V反總÷(Cpr×V樣)÷T

= 147×（△A測定管-△A空白管）÷Cpr

(2). 按樣本質量計算

活性單位定義(yi) ：在25℃或者37℃中，每克樣本每分鍾催化1nmol DTNB還原為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

TrxR（nmol/min /g 鮮重）=（△A測定管-△A空白管）÷ε÷d×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T

= 147×（△A測定管-△A空白管）÷W

（3）按細胞數量計算

活性單位定義(yi) ：在25℃或者37℃中，每104個(ge) 細胞每分鍾催化1nmol DTNB還原為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

TrxR（nmol/min/104 cell）=（△A測定管-△A空白管）÷ε÷d×V反總÷(細胞數量×V樣÷V樣總)÷T

= 147×（△A測定管-△A空白管）÷ 細胞數量

（4）按液體(ti) 體(ti) 積計算

活性單位定義(yi) ：在25℃或者37℃中，每毫升液體(ti) 每分鍾催化1nmol DTNB還原為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

TrxR（nmol/min /mL）=（△A測定管-△A空白管）÷ε÷d×V反總÷V樣÷T

= 147×（△A測定管-△A空白管）

ε：TNB在412nm處的微摩爾消光係數，0.0136 L/μ mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積（L），200μL=2×10-4 L；Cpr：上清液蛋白質濃度（mg/mL），需要另外測定；W ：樣品質量；V樣：加入反應體(ti) 係中上清液體(ti) 積（mL），20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體(ti) 積，1 mL；T：反應時間（min），5 min。

b.使用96孔板測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義(yi) ：在25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分鍾催化1nmol DTNB還原為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

TrxR（nmol/min /mg prot）=（△A測定管-△A空白管）÷ε÷d×V反總÷(Cpr×V樣)÷T

= 294×（△A測定管-△A空白管）÷Cpr

(2). 按樣本質量計算

活性單位定義(yi) ：在25℃或者37℃中，每克樣本每分鍾催化1nmol DTNB還原為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

TrxR（nmol/min /g 鮮重）=（△A測定管-△A空白管）÷ε÷d×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T

= 294×（△A測定管-△A空白管）÷W

（3）按細胞數量計算

活性單位定義(yi) ：在25℃或者37℃中，每104個(ge) 細胞每分鍾催化1nmol DTNB還原為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

TrxR（nmol/min/104 cell）=（△A測定管-△A空白管）÷ε÷d×V反總÷(細胞數量×V樣÷V樣總)÷T

= 294×（△A測定管-△A空白管）÷ 細胞數量

（4）按液體(ti) 體(ti) 積計算

活性單位定義(yi) ：在25℃或者37℃中，每毫升液體(ti) 每分鍾催化1nmol DTNB還原為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

TrxR（nmol/min /mL）=（△A測定管-△A空白管）÷ε÷d×V反總÷V樣÷T

= 294×（△A測定管-△A空白管）

ε：TNB在412nm處的微摩爾消光係數，0.0136 L/μ mol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積（L），200μL=2×10-4 L；Cpr：上清液蛋白質濃度（mg/mL），需要另外測定；W ：樣品質量；V樣：加入反應體(ti) 係中上清液體(ti) 積（mL），20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體(ti) 積，1 mL；T：反應時間（min），5 min。

注意事項：

測定前須先取1～2個(ge) 樣做預實驗，哺乳動物組織及血液製品TrxR活力測定時，一般須用蒸餾水稀釋5倍左右；測定過程操作須迅速。

試劑二和試劑三配製好後3天內(nei) 使用完。

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