穀胱甘肽過氧化物酶（GPX）測試盒

穀胱甘肽過氧化物酶（GPX）測試盒

微量法 100T/96S

注意：正式測定之前選擇2-3個(ge) 預期差異大的樣本做預測定。

測定意義(yi) ：

GSH-Px是穀胱甘肽氧化還原循環中催化還原型穀胱甘肽（GSH）氧化的主要酶之一。GSH-Px不僅(jin) 能夠特異地催化還原型穀胱甘肽與(yu) ROS反應，生成氧化型穀胱甘肽GSSG，從(cong) 而保護生物膜免受ROS的損害，維持細胞的正常功能；而且具有保護肝髒、提高機體(ti) 免疫力、拮抗有害金屬離子對機體(ti) 的傷(shang) 害和增加機體(ti) 抗輻射等能力。

測定原理：

GSH-Px催化有機過氧化物氧化GSH，產(chan) 生GSSG；穀胱甘肽還原酶（GR）催化NADPH還原GSSG，再生GSH，同時NADPH氧化生成NADP+；NADPH在340 nm有特征吸收峰，而NADP+沒有；通過測定340 nm光吸收減少速率來計算GSH-Px活性。

自備儀(yi) 器和用品：

低溫離心機、水浴鍋、可調節移液器、酶標儀(yi) 、96孔板、和蒸餾水。

試劑組成和配置：

試劑一：液體(ti) 120mL×1瓶，室溫保存。

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。

試劑三：液體(ti) 10μL×1支，-20℃保存。

試劑四：液體(ti) 200μL×1瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

1. 組織：按照組織質量（g）：試劑一體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。

2. 細菌、真菌：按照細胞數量（104個(ge) ）：試劑一體(ti) 積（mL）為(wei) 500~1000：1的比例（建議500萬(wan) 細胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然後8000g，4℃，離心10min，取上清置於(yu) 冰上待測。

3. 血清等液體(ti) ：直接測定。

GSH-Px測定操作：

1. 酶標儀(yi) 預熱30 min，調節波長到340 nm。

2. 混合試劑在25℃或者37℃（哺乳動物）水浴中預熱30min。

3. 混合試劑配製：臨(lin) 用前，在試劑二中加入試劑一20 mL，充分震蕩溶解後加入全部試劑三，混勻。（當天用完）

4. 試劑四的稀釋：吸取21.5μL試劑四，加入5mL蒸餾水充分混勻，臨(lin) 用前配製，配製好的試劑當天使用。

5. 測定管：依次在96孔板中加入20μL上清液、160μL預熱的混合試劑、20μL稀釋後的試劑四，迅速混勻後於(yu) 340nm處測定第30 s和第210s的吸光值，分別記為(wei) A1和A2。△A測定管= A1﹣A2。

GSH-Px活性計算：

使用96孔板測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

GSH-Px活力單位定義(yi) ：一定溫度中，每mg蛋白每分鍾催化1nmol NADPH氧化為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

GSH-Px (nmol/min/mg prot)=[△A÷ε÷d×V反總×109]÷（Cpr×V樣）÷T

=1072×△A÷Cpr

(2). 按樣本質量計算

GSH-Px活力單位定義(yi) ：一定溫度中，每g樣本每分鍾催化1nmol NADPH氧化為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

GSH-Px (nmol/min/g 鮮重)=[△A÷ε÷d×V反總×109]÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=1072×△A÷W

（3）按細胞數量計算

活性單位定義(yi) ：一定溫度中，每104個(ge) 細胞每分鍾催化1nmol NADPH氧化為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

GSH-Px (nmol/min/104 cell)= [△A÷ε÷d×V反總×109]÷(細胞數量×V樣÷V樣總)÷T

=1072×△A÷細胞數量

（4）按液體(ti) 體(ti) 積計算

活性單位定義(yi) ：一定溫度中，每毫升液體(ti) 每分鍾催化1nmol NADPH氧化為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

GSH-Px (nmol/min/mL)=[△A÷ε÷d×V反總×109]÷V樣÷T

=1072×△A

ε：NADPH摩爾消光係數6.22×103L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5 cm；V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，200μL=2×10-4 L；106：1 mol=1×106μmol； Cpr：上清液蛋白濃度（mg/mL）；W ：樣品質量；V樣：加入反應體(ti) 係中上清液體(ti) 積，20μL =2×10-2 mL；V樣總：提取液體(ti) 積，1 mL；T：反應時間，3 min。

注意事項：

（1）樣品處理等過程均需要在冰上進行，且須在當日測定酶活力；

（2）混合試劑和底物液須臨(lin) 用前配製，配完後置於(yu) 冰上，當天使用完；

（3）測定過程操作須迅速；

（4）細胞中GSH-Px活性測定時，細胞數目須在300萬(wan) -500萬(wan) 之間，細胞中GSH-Px的提取時可加試劑一後研磨或超聲波處理，不能用細胞裂解液處理細胞。

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