穀胱甘肽還原酶（GR）測試盒

穀胱甘肽還原酶（GR）測試盒

微量法 100T/96S

注意：正式測定之前選擇2-3個(ge) 預期差異大的樣本做預測定。

測定意義(yi) ：

GR是廣泛存在於(yu) 真核和原核生物中的一種黃素蛋白氧化還原酶，是穀胱甘肽氧化還原循環的關(guan) 鍵酶之一（通常昆蟲中GR被TrxR取代）。GR催化NADPH還原GSSG生成GSH，有助於(yu) 維持體(ti) 內(nei) GSH/GSSG比值。GR在氧化脅迫反應中對活性氧清除起關(guan) 鍵作用，此外GR還參與(yu) 抗壞血酸－穀胱甘肽循環途徑。

測定原理：

GR能催化NADPH還原GSSG再生GSH，同時NADPH脫氫生成NADP+；NADPH在340 nm有特征吸收峰，相反NADP+在該波長無吸收峰；通過測定340 nm吸光度下降速率來測定NADPH脫氫速率，從(cong) 而計算GR活性。

自備儀(yi) 器和用品：

低溫離心機、水浴鍋、移液器、紫外分光光度計/酶標儀(yi) 、微量石英比色皿/96孔板、和蒸餾水

試劑組成和配置：

試劑一：液體(ti) 120mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×2支，-20℃保存。臨(lin) 用前加入1.2mL蒸餾水，混勻。

試劑三：粉劑×2支，-20℃保存。臨(lin) 用前加入0.6mL蒸餾水，混勻。

粗酶液提取：

1. 組織：按照組織質量（g）：試劑一體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心15min，取上清，置冰上待測。

2. 細菌、真菌：按照細胞數量（104個(ge) ）：試劑一體(ti) 積（mL）為(wei) 500~1000：1的比例（建議500萬(wan) 細胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然後8000g，4℃，離心15min，取上清置於(yu) 冰上待測。

3. 血清等液體(ti) ：直接測定。

操作步驟：

1. 分光光度計/酶標儀(yi) 預熱30 min，調節波長到340 nm，蒸餾水調零。

2. 試劑一置於(yu) 25℃（普通物質）或者37℃（哺乳動物）中預熱30min。

3. 測定管：取微量石英比色皿或96孔板，依次加入10μL試劑三，20μL試劑二，150μL試劑一，20μL上清液，混勻，於(yu) 340nm迅速測定初始吸光度和180 s吸光度，記為(wei) A測1和A測2，△A測定管= A測1﹣A測2。

(注意：

1. 加完上清液後必須迅速混勻測定，保證準確測出初始反應速度；

2. 當出現初始180s內(nei) 吸光值不穩定時，可以適當延長反應時間，選取相對穩定的時間段內(nei) 吸光值變化值；

3.當所測△A測定管的值在零點附近徘徊時，可能原因：（1）樣本GR酶活性低，建議濃縮樣本後再進行測定；（2）樣本GR酶活性過高，吸光值變化區間過小無法準確測出，建議樣本稀釋2~5倍後再進行測定)

計算公式：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義(yi) ：在一定溫度中，pH8.0條件下，每毫克蛋白每分鍾催化1nmol NADPH氧化為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

GR酶活(nmol/min/mg prot)= [ △A測定管÷ε÷d×V反總×109]÷[Cpr×V樣]÷T

= 536×△A測定管÷Cpr

(2). 按樣本質量計算

活性單位定義(yi) ：在一定溫度中，pH8.0條件下，每克樣本每分鍾催化1nmol NADPH氧化為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

GR酶活(nmol/min/g 鮮重)= [ △A測定管÷ε÷d×V反總×109] ÷(W×V樣÷V樣總)÷T

= 536×△A測定管÷W

(3) 按細胞數量計算

活性單位定義(yi) ：在一定溫度中，pH8.0條件下，每104個(ge) 細胞每分鍾催化1nmol NADPH氧化為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

GR酶活(nmol/min/104 cell)= [ △A測定管÷ε÷d×V反總×109] ÷(細胞數量×V樣÷V樣總)÷T            

= 536×△A測定管÷細胞數量

（4）按液體(ti) 體(ti) 積計算

活性單位定義(yi) ：在一定溫度中，pH8.0條件下，每毫升液體(ti) 每分鍾催化1nmol NADPH氧化為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

GR酶活(nmol/min/mL)= [ △A測定管÷ε÷d×V反總×109]÷×V樣÷T

= 536×△A測定管

ε：NADPH摩爾消光係數6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光徑，1 cm；V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，200μL=2×10-4 L；106：1 mol=1×106μmol； Cpr：上清液蛋白濃度（mg/mL）；W ：樣品質量；V樣：加入反應體(ti) 係中上清液體(ti) 積，20μL =2×10-2 mL；V樣總：提取液體(ti) 積，1 mL；V樣總：提取液體(ti) 積，1 mL；T：反應時間，3 min。

b.使用96孔板測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義(yi) ：在一定溫度中，pH8.0條件下，每毫克蛋白每分鍾催化1nmol NADPH氧化為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

GR酶活(nmol/min/mg prot)= [ △A測定管÷ε÷d×V反總×109]÷[Cpr×V樣]÷T

= 1072×△A測定管÷Cpr

(2). 按樣本質量計算

活性單位定義(yi) ：在一定溫度中，pH8.0條件下，每克樣本每分鍾催化1nmol NADPH氧化為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

GR酶活(nmol/min/g 鮮重)= [ △A測定管÷ε÷d×V反總×109] ÷(W×V樣÷V樣總)÷T

= 1072×△A測定管÷W

(3) 按細胞數量計算

活性單位定義(yi) ：在一定溫度中，pH8.0條件下，每104個(ge) 細胞每分鍾催化1nmol NADPH氧化為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

GR酶活(nmol/min/104 cell)= [ △A測定管÷ε÷d×V反總×109] ÷(細胞數量×V樣÷V樣總)÷T            

=1072×△A測定管÷細胞數量

（4）按液體(ti) 體(ti) 積計算

活性單位定義(yi) ：在一定溫度中，pH8.0條件下，每毫升液體(ti) 每分鍾催化1nmol NADPH氧化為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

GR酶活(nmol/min/mL)= [ (△A測定管-△A空白管)÷ε÷d×V反總×109]÷×V樣÷T

=1072×△A測定管

ε：NADPH摩爾消光係數6.22×103L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5 cm；V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，200μL=2×10-4 L；106：1 mol=1×106μmol； Cpr：上清液蛋白濃度（mg/mL）；W ：樣品質量；V樣：加入反應體(ti) 係中上清液體(ti) 積，20μL =2×10-2 mL；V樣總：提取液體(ti) 積，1 mL；V樣總：提取液體(ti) 積，1 mL；T：反應時間，3 min。

注意事項：

（1）樣品處理等過程均需要在冰上進行，且須在當日測定酶活力，勻漿液避免反複凍融；

（2）試劑二和試劑三須現配現用，配製完後，置於(yu) 冰上，未使用完的4℃保存，三天內(nei) 使用完。

（3）測定前須先用1～2個(ge) 樣做預實驗，哺乳動物組織一般須用試劑一稀釋2～5倍。

（4）細胞中GR活性測定時，細胞數目須在300萬(wan) -500萬(wan) 之間，細胞中GR的提取時可加試劑一後研磨或超聲波處理，不能用細胞裂解液處理細胞。

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