穀胱甘肽S轉移酶（GST）測試盒

穀胱甘肽S轉移酶（GST）測試盒

微量法 100T/96S

注意：正式測定之前選擇2-3個(ge) 預期差異大的樣本做預測定。

測定意義(yi) ：

GST是一種具有多種生理功能的蛋白質家族，主要存在於(yu) 細胞質內(nei) 。GST是體(ti) 內(nei) 解毒酶係統的重要組成部分，主要催化各種化學物質及其代謝產(chan) 物與(yu) GSH的巰基共價(jia) 結合，使親(qin) 電化合物變為(wei) 親(qin) 水物質，易於(yu) 從(cong) 膽汁或尿液中排泄，達到將體(ti) 內(nei) 各種潛在或具備毒性的物質降解並排出體(ti) 外的目的。因此，GST在保護細胞免受親(qin) 電子化合物的損傷(shang) 中發揮著重要的生物學功能。此外，因為(wei) GST具有GSH-Px活性，亦稱為(wei) non-Se GSH-Px，具有修複氧化破壞的大分子如DNA、蛋白質等的功能。注意，GST催化的反應減少GSH含量，但是不增加GSSG含量。

測定原理：

GST催化GSH與(yu) CDNB結合，其結合產(chan) 物的光吸收峰波長為(wei) 340nm；通過測定340nm波長處吸光度上升速率，即可計算出GST活性。

自備儀(yi) 器和用品：

低溫離心機、水浴鍋、可調節移液器、紫外分光光度計/酶標儀(yi) 、微量石英比色皿/96孔板、和蒸餾水。

試劑組成和配置：

試劑一：液體(ti) 120mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體(ti) 22mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。臨(lin) 用前加2 mL蒸餾水溶解。

粗酶液提取：

1. 組織：按照組織質量（g）：試劑一體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。

2. 細菌、真菌：按照細胞數量（104個(ge) ）：試劑一體(ti) 積（mL）為(wei) 500~1000：1的比例（建議500萬(wan) 細胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然後8000g，4℃，離心10min，取上清置於(yu) 冰上待測。

3.  血清等液體(ti) ：直接測定。

測定：

1. 分光光度計/酶標儀(yi) 預熱30 min，調節波長到340 nm，用蒸餾水調零。

2. 試劑三放在25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動物）保溫。

3. 測定管：取微量石英比色皿或96孔板，加入20μL上清液，180μL試劑二和20μL試劑三，迅速混勻後於(yu) 340nm測定吸光度變化，記錄10 s和310 s吸光度為(wei) A1和A2。

GST活性計算公式：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義(yi) ：在25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分鍾催化1nmol/L CDNB與(yu) GSH結合為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

GST（nmol/min/mg prot）=(A2-A1)÷ε÷d×109×V反總÷(Cpr×V樣)÷T

=230×(A2-A1) ÷Cpr

(2). 按樣本質量計算

活性單位定義(yi) ：在25℃或者37℃中，每克樣品每分鍾催化1nmol/L CDNB與(yu) GSH結合為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

GST（nmol/min/g 鮮重）=(A2-A1)÷ε÷d×109×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=230×(A2-A1)÷W

（3）按細胞數量計算

活性單位定義(yi) ：在25℃或者37℃中，每104個(ge) 細胞每分鍾催化1nmol/L CDNB與(yu) GSH結合為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

GST（nmol/min/104 cell）=(A2-A1)÷ε÷d×109×V反總÷(細胞數量×V樣÷V樣總)÷T

=230×(A2-A1) ÷細胞數量

（4）按液體(ti) 體(ti) 積計算

活性單位定義(yi) ：在25℃或者37℃中，每毫升液體(ti) 每分鍾催化1nmol/L CDNB與(yu) GSH結合為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

GST（nmol/min/mL）=(A2-A1)÷ε÷d×109×V反總÷V樣÷T

                   = 230×(A2-A1)

ε：產(chan) 物摩爾消光係數，9.6×103 L/mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；106：1mol=1×106μmol；V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，220μL=2.2×10-4 L；Cpr：上清液蛋白質濃度（mg/mL），需要另外測定，建議選用本公司生產(chan) 的BCA蛋白質濃度測定試劑盒；W ：樣品質量；V樣：加入反應體(ti) 係中上清液體(ti) 積，20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體(ti) 積，1 mL；T：反應時間（min），5min。

b.使用96孔板測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義(yi) ：在25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分鍾催化1nmol/L CDNB與(yu) GSH結合為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

GST（nmol/min/mg prot）=(A2-A1)÷ε÷d×109×V反總÷(Cpr×V樣)÷T

=460×(A2-A1) ÷Cpr

(2). 按樣本質量計算

活性單位定義(yi) ：在25℃或者37℃中，每克樣品每分鍾催化1nmol/L CDNB與(yu) GSH結合為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

GST（nmol/min/g 鮮重）=(A2-A1)÷ε÷d×109×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=460×(A2-A1)÷W

（3）按細胞數量計算

活性單位定義(yi) ：在25℃或者37℃中，每104個(ge) 細胞每分鍾催化1nmol/L CDNB與(yu) GSH結合為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

GST（nmol/min/104 cell）=(A2-A1)÷ε÷d×109×V反總÷(細胞數量×V樣÷V樣總)÷T

=460×(A2-A1)÷細胞數量

（4）按液體(ti) 體(ti) 積計算

活性單位定義(yi) ：在25℃或者37℃中，每毫升液體(ti) 每分鍾催化1nmol/L CDNB與(yu) GSH結合為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

GST（nmol/min/mL）=(A2-A1)÷ε÷d×109×V反總÷V樣÷T

                   =460×(A2-A1)

ε：產(chan) 物摩爾消光係數，9.6×103 L/mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；106：1mol=1×106μmol；V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，220μL=2.2×10-4 L；Cpr：上清液蛋白質濃度（mg/mL），需要另外測定，建議選用本公司生產(chan) 的BCA蛋白質濃度測定試劑盒；W ：樣品質量；V樣：加入反應體(ti) 係中上清液體(ti) 積，20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體(ti) 積，1 mL；T：反應時間（min），5min。

注意事項：

1. 樣品處理等過程均需要在冰上進行，且須在當日測定酶活力；

2. 細胞中GST活性測定時，細胞數目須在300萬(wan) -500萬(wan) 之間，細胞中GST的提取時可加試劑一後研磨或超聲波處理，不能用細胞裂解液處理細胞；

3. 本法測定GST活性的線性範圍可達76 μmol/min /L，測定前先用1～2個(ge) 樣做預實驗，如5min內(nei) 反應不成線性，須對樣品用蒸餾水稀釋，計算結果乘以稀釋倍數；

4. 測定反映的溫度對測定結果有影響，請控製在25℃或者37℃（哺乳動物）。

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