果糖1,6二磷酸酶(FBP)測試盒

果糖1,6二磷酸酯酶測試盒

微量法 100管/96樣

正式測定前務必取2-3個(ge) 預期差異較大的樣本做預測定

測定意義(yi)

果糖-1,6二磷酸酶又稱果糖1,6二磷酸酯酶，催化1,6二磷酸果糖和水生成6磷酸果糖和無機磷，在糖的異生代謝和光合作用同化物蔗糖的合成中起關(guan) 鍵性的作用。

測定原理

FBP催化1,6二磷酸果糖和水生成6磷酸果糖和無機磷，在反應體(ti) 係中添加的磷酸葡萄糖異構酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH，340nm下測定NADPH增加速率，即可計算FBP活性。

需自備的儀(yi) 器和用品

分光光度計/酶標儀(yi) 、恒溫水浴鍋、台式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配製

提取液一：液體(ti) 100mL×1瓶，4℃保存。

提取液二：液體(ti) 100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨(lin) 用前加入20mL試劑四充分溶解待用，用不完的試劑4℃保存；

試劑二：液體(ti) 7.2μL×1支，4℃保存；臨(lin) 用前加入1mL蒸餾水充分溶解待用，用不完的試劑4℃保存；

試劑三：粉劑×1支，-20℃保存；臨(lin) 用前加入1mL蒸餾水充分溶解待用，用不完的試劑4℃保存；

試劑四：液體(ti) 25mL×1瓶， 4℃保存；

樣本的前處理

①總FBP酶提取：建議稱取約0.1g樣本，加入1mL提取液一，冰浴勻漿後超聲破碎（冰浴，200W，破碎3s，間歇7s，總時間1min），然後4℃，8000g離心10min，取上清測定。

②胞漿和葉綠體(ti) FBP酶的分離：按照植物組織質量（g）：提取液體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5～10的比例（建議稱取約0.1g樣本，加入1mL提取液一），冰浴勻漿後於(yu) 4℃，200g離心5min，棄沉澱，取上清在4℃，8000g離心10min，取上清用於(yu) 測定胞漿FBP酶活性，取沉澱加1mL提取液二，震蕩溶解後超聲破碎（冰浴，200W，破碎3s，間歇7s，總時間1min），然後4℃，8000g離心10min，取上清測定葉綠體(ti) 中FBP酶活性。

建議測定總FBP酶活性，按照步驟①提取粗酶液，若需要分別測定胞漿和葉綠體(ti) 中的FBP，則按照步驟②提取粗酶液。

測定步驟

1. 分光光度計或酶標儀(yi) 預熱30min以上，調節波長至340nm，蒸餾水調零。

2. 將試劑一、二、三37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)預熱10分鍾。

3. 加樣表：

將上述試劑按順序加入微量石英比色皿或96孔板中，立即混勻，加入最後一個(ge) 試劑的同時開始計時，在340 nm波長下記錄反應1min後吸光度A1和反應6min後的吸光度A2，計算ΔA=A2-A1。

FBP活性計算

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計算

單位的定義(yi) ：每mg組織蛋白每分鍾生成1 nmol的NADPH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

FBP（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=321.5×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位的定義(yi) ：每g組織每分鍾生成1 nmol的NADPH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

FBP（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=321.5×ΔA÷W

V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，2×10-4 L；ε：NADPH摩爾消光係數，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體(ti) 積，0.02 mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，1 mL；T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g。

b.用96孔板測定的計算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計算

單位的定義(yi) ：每mg組織蛋白每分鍾生成1 nmol的NADPH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

FBP（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位的定義(yi) ：每g組織每分鍾生成1 nmol的NADPH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

FBP（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=643×ΔA÷W

V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，2×10-4 L；ε：NADPH摩爾消光係數，6.22×103 L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體(ti) 積，0.02mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，1 mL；T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g。

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