果糖1,6二磷酸醛縮酶(FBA)測試盒

果糖1,6二磷酸醛縮酶(FBA)測試盒

微量法100T/96S

注意：正式測定之前選擇2-3個(ge) 預期差異大的樣本做預測定。

測定意義(yi)

植物葉綠體(ti) 中果糖1,6-二磷酸醛縮酶是光合作用中參與(yu) calvin循環的重要酶。催化果糖1,6-二磷酸和景天庚酮糖1,7-二磷酸的合成反應，在各種逆境脅迫下表現不同的響應。

測定原理

果糖1,6-二磷酸醛縮酶催化果糖1,6-二磷酸生成3-磷酸甘油醛和磷酸二羥丙酮，在磷酸丙糖異構酶和α-磷酸甘油脫氫酶作用下催化NADH和磷酸二羥丙酮生成NAD和α-磷酸甘油，340nm處吸光值的變化可反映果糖1,6-二磷酸醛縮酶活性的高低。

自備實驗用品及儀(yi) 器

天平、震蕩儀(yi) 、低溫離心機、研缽、紫外分光光度計/酶標儀(yi) 、微量石英比色皿/96孔板。

試劑組成和配製   

提取液一：液體(ti) 100mL×1瓶，4℃保存。

提取液二：液體(ti) 100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體(ti) 10mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑二：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。臨(lin) 用前加2mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝後-20℃保存，禁止反複凍融。

試劑三：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。臨(lin) 用前加2 mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝後-20℃保存，禁止反複凍融。

試劑四：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。臨(lin) 用前加2 mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝後-20℃保存，禁止反複凍融。

試劑五：液體(ti) 2mL×1瓶，4℃避光保存。

酶液提取

①總FDA酶提取：建議稱取約0.1g樣本，加入1mL提取液一，冰浴勻漿後超聲破碎（冰浴，200W，破碎3s，間歇7s，總時間1min），然後4℃，8000g離心10min，取上清測定。

②胞漿和葉綠體(ti) FDA酶的分離：按照植物組織質量（g）：提取液體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5～10的比例（建議稱取約0.1g樣本，加入1mL提取液一），冰浴勻漿後於(yu) 4℃，200g離心5min，棄沉澱，取上清在4℃，8000g離心10min，取上清用於(yu) 測定胞漿FDA酶活性，取沉澱加1mL提取液二，震蕩溶解後超聲破碎（冰浴，200W，破碎3s，間歇7s，總時間1min），然後4℃，8000g離心10min，取上清測定葉綠體(ti) 中FDA酶活性。

建議測定總FDA酶活性，按照步驟①提取粗酶液，若需要分別測定胞漿和葉綠體(ti) 中的FDA，則按照步驟②提取粗酶液。

測定操作

1. 紫外分光光度計/酶標儀(yi) 預熱30min，調節波長至340nm，蒸餾水調零。

2. 取微量石英比色皿/96孔板，依次加入100μL試劑一，20μL試劑二，20μL試劑三，20μL試劑四，20μL試劑五，20μL粗酶液，充分混勻，記錄340nm處10s的吸光值A1和310s的吸光值A2，△A=A1-A2

計算公式

1. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按照樣本蛋白濃度計算

酶活單位定義(yi) ：每毫克組織蛋白每分鍾消耗1 nmol的NADH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

FDA（nmol/min/mg prot）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

（2）按照樣本質量計算

酶活單位定義(yi) ：每克組織每分消耗1 nmol的NADH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

FDA（nmol/min/g 鮮重）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=321.54×ΔA÷W

（3）按照細胞數量計算

酶活單位定義(yi) ：每104個(ge) 細胞每分鍾消耗1 nmol的NADH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

FDA（nmol/min/104 cell）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×細胞數量÷V樣總) ÷T

                = 321.54×ΔA÷細胞數量

（4）按照液體(ti) 體(ti) 積計算

酶活單位定義(yi) ：每毫升液體(ti) 每分鍾消耗1 nmol的NADH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

FDA（nmol/min/mL）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷V樣÷T=321.54×ΔA

V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，0.2mL；ε：NADH摩爾消光係數，6.22×103 L/mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體(ti) 積，0.02mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，1mL；T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g

2. 用96孔板測定的計算公式如下

（1）按照樣本蛋白濃度計算

酶活單位定義(yi) ：每毫克組織蛋白每分鍾消耗1 nmol的NADH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

FDA（nmol/min/mg prot）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T= 643.08×ΔA÷Cpr

（2）按照樣本質量計算

酶活單位定義(yi) ：每克組織每分消耗1 nmol的NADH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

FDA（nmol/min/g 鮮重）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T= 643.08×ΔA÷W

（3）按照細胞數量計算

酶活單位定義(yi) ：每104個(ge) 細胞每分鍾消耗1 nmol的NADH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

FDA（nmol/min/104 cell）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×細胞數量÷V樣總) ÷T

                = 643.08×ΔA÷細胞數量

（4）按照液體(ti) 體(ti) 積計算

酶活單位定義(yi) ：每毫升液體(ti) 每分鍾消耗1 nmol的NADH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

FDA（nmol/min/mL）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷V樣÷T= 643.08×ΔAV反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，0.2mL；ε：NADH摩爾消光係數，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體(ti) 積，0.02mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，1mL；T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g

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