多酚氧化酶(PPO）測試盒

多酚氧化酶(PPO）測試盒

微量法 100管/48樣

正式測定前務必取2-3個(ge) 預期差異較大的樣本做預測定

測定意義(yi) ：                           

PPO（EC1.10.3.1）主要存在於(yu) 動物、植物、微生物和培養(yang) 細胞中，是一種含銅的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化產(chan) 生醌，從(cong) 而引起褐化，與(yu) 果蔬加工、茶葉品質和組培等密切相關(guan) 。

測定原理：

PPO能夠催化鄰苯二酚產(chan) 生醌，後者在525nm有特征光吸收。

需自備的儀(yi) 器和用品：

可見分光光度計/酶標儀(yi) 、台式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配製：

提取液：100mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：20mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：5mL×1瓶，4℃保存；

粗酶液提取：

1、細菌、細胞或組織樣品的製備：

細菌或培養(yang) 細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nei) ，離心後棄上清；按照細菌或細胞數量（104個(ge) ）：提取液體(ti) 積（mL）為(wei) 500~1000：1的比例（建議500萬(wan) 細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重複30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質量（g）：提取液體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）或果汁樣本的處理：

按照血清（漿）或果汁體(ti) 積（mL）：提取液體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5~10的比例（建議取0.1mL血清（漿）或果汁加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1. 分光光度計或酶標儀(yi) 預熱30min以上，調節波長至525nm，蒸餾水調零。

2. 樣本測定（在EP管中依次加入下列試劑）

37℃(哺乳動物)或25℃（其它物種）中準確水浴10min後，95℃水浴5min，冷卻至室溫，10000g，25℃離心10min，收集上清，取200μL至微量石英比色皿或96孔板中，525nm處檢測測定管和對照管吸光度，計算ΔA=A測定-A對照。

注意：煮沸樣本的操作：取300μL離心上清於(yu) EP管中，進行5min 95℃水浴處理；每個(ge) 測定管需要設一個(ge) 對照管，可以在不同對照管中加入不同樣品的粗酶液，然後集中進行5min 95℃水浴處理。

PPO活性計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、血清（漿）或果汁PPO活性

單位的定義(yi) ：每分鍾每mL血清（漿）或果汁在每mL反應體(ti) 係中使525nm處吸光值變化

0.01為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

PPO（U/mL）=ΔA×V反總÷(V液× V樣÷V樣總)÷0.01÷T =60×ΔA÷V液

2、組織、細菌或細胞PPO活性

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位定義(yi) ：每分鍾每mg組織蛋白在每mL反應體(ti) 係中使525nm處吸光值變化0.01為(wei) 一個(ge)

酶活力單位。

PPO（U/mg prot）=ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.01÷T =60×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

（2）按樣本鮮重計算：

單位定義(yi) ：每分鍾每g組織在每mL反應體(ti) 係中使525nm處吸光值變化0.01為(wei) 一個(ge)

酶活力單位。

PPO（U/g 鮮重）=ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.01÷T =60×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位定義(yi) ：每分鍾每1萬(wan) 個(ge) 細菌或細胞在每mL反應體(ti) 係中使525nm處吸光值變化0.01為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

PPO（U/104 cell）=ΔA×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷0.01÷T =0.12×ΔA

V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，0.3mL；V液：加入血清（漿）或果汁體(ti) 積，0.1mL； V樣：加入樣本體(ti) 積，0.05mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，1 mL；T：反應時間，10 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細胞或細菌總數，500萬(wan) 。

b.用96孔板測定的計算公式如下

1、血清（漿）或果汁PPO活性

單位的定義(yi) ：每分鍾每mL血清（漿）或果汁在每mL反應體(ti) 係中使525nm處吸光值變化

0.005為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

PPO（U/mL）=ΔA×V反總÷(V液× V樣÷V樣總)÷0.005÷T =120×ΔA÷V液

2、組織、細菌或細胞PPO活性

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位定義(yi) ：每分鍾每mg組織蛋白在每mL反應體(ti) 係中使525nm處吸光值變化0.005為(wei) 一個(ge)

酶活力單位。

PPO（U/mg prot）=ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.005÷T =120×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

（2）按樣本鮮重計算：

單位定義(yi) ：每分鍾每g組織在每mL反應體(ti) 係中使525nm處吸光值變化0.005為(wei) 一個(ge)

酶活力單位。

PPO（U/g 鮮重）=ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.005÷T =120×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位定義(yi) ：每分鍾每1萬(wan) 個(ge) 細菌或細胞在每mL反應體(ti) 係中使525nm處吸光值變化0.005為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

PPO（U/104 cell）=ΔA×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷0.005÷T =0.24×ΔA

V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，0.3mL；V液：加入血清（漿）或果汁體(ti) 積，0.1mL； V樣：加入樣本體(ti) 積，0.05mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，1 mL；T：反應時間，10 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細胞或細菌總數，500萬(wan) 。

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