亮氨酸氨基肽酶（LAP）測試盒

亮氨酸氨基肽酶（LAP）測試盒

微量法 100管/96樣

正式測定前務必取2-3個(ge) 預期差異較大的樣本做預測定

測定意義(yi) ：                           

LAP是一類能水解肽鏈N-末端為(wei) 亮氨酸的酶，廣泛存在於(yu) 肝、腎、胰等組織中，尤其以肝髒中含量最為(wei) 豐(feng) 富。各類肝病患者因肝細胞損傷(shang) ，血清LAP的活性均有不同程度的升高，因此，血清LAP活性的檢測能從(cong) 不同側(ce) 麵反映各種肝病的發生和發展。

測定原理：

LAP分解L-亮氨酰對硝基苯胺生成對硝基苯胺，後者在405nm有最大吸收峰，通過測定吸光值升高速率來計算LAP活性。

自備用品：

酶標儀(yi) /可見分光光度計、台式離心機、水浴鍋、可調式移液器、96孔板/微量石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配製：

提取液：液體(ti) 100mL×1瓶，4℃保存； 

試劑一：液體(ti) 15mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1瓶，-20℃保存；

樣本的前處理： 

1、細菌、細胞或組織樣品的製備：

細菌或培養(yang) 細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nei) ，離心後棄上清；按照細菌或細胞數量（104個(ge) ）：提取液體(ti) 積（mL）為(wei) 1000~5000：1的比例（建議2000萬(wan) 細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重複30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質量（g）：提取液體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

LAP測定步驟：

1. 分光光度計或酶標儀(yi) 預熱30min以上，調節波長至405nm，蒸餾水調零。

2. 將試劑二轉移至試劑一中充分溶解（如較難溶解，可50℃水浴加熱約30min促進溶解）；在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴10min以上；用不完的試劑分裝後-20℃保存，禁止反複凍融。

3. 在微量石英比色皿或96孔板中加入50μL樣本和150μL試劑一，混勻後立即記錄405nm處初始吸光值A1和 2min後的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1。

注意事項：若ΔA大於(yu) 0.5，需將酶液用提取液稀釋，計算公式中乘以相應稀釋倍數。使A2-A1小於(yu) 0.5，可提高檢測靈敏度。

LAP活力單位的計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、血清（漿）LAP活力的計算:

單位的定義(yi) ：每mL血清（漿）每分鍾生成1 nmol的對硝基苯胺定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

LAP（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=205.8×ΔA

2、組織、細菌或細胞中LAP活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義(yi) ：每mg組織蛋白每分鍾生成1 nmol 對硝基苯胺定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

LAP（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=205.8×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義(yi) ：每g組織每分鍾生成1 nmol 對硝基苯胺定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

LAP（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=205.8×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義(yi) ：每1萬(wan) 個(ge) 細菌或細胞每分鍾生成1 nmol 對硝基苯胺定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

LAP（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(2000×V樣÷V樣總) ÷T=0.103×ΔA

V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，2×10-4 L；ε：對硝基苯胺摩爾消光係數，9.72×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體(ti) 積，0.05 mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，1 mL；T：反應時間，2 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；2000：細菌或細胞總數，2000萬(wan) 。

b.用96孔板測定的計算公式如下

1、血清（漿）LAP活力的計算:

單位的定義(yi) ：每mL血清（漿）每分鍾生成1 nmol的對硝基苯胺定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

LAP（nmol/min /mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=411.5×ΔA

2、組織、細菌或細胞中LAP活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義(yi) ：每mg組織蛋白每分鍾生成1 nmol 對硝基苯胺定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

LAP（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷ (V樣×Cpr) ÷T=411.5×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義(yi) ：每g組織每分鍾生成1 nmol 對硝基苯胺定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

LAP（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=411.5×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義(yi) ：每1萬(wan) 個(ge) 細菌或細胞每分鍾生成1 nmol 對硝基苯胺定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

LAP（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(2000×V樣÷V樣總) ÷T=0.206×ΔA

V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，2×10-4 L；ε：對硝基苯胺摩爾消光係數，9.72×103 L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體(ti) 積，0.05 mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，1 mL；T：反應時間，2min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；2000：細菌或細胞總數，2000萬(wan) 。

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