γ穀氨酰半胱氨酸連接酶（GCL）測試盒

γ穀氨酰半胱氨酸連接酶（GCL）測試盒

注意：正式測定之前選擇2-3個(ge) 預期差異大的樣本做預測定。

測定意義(yi) ：

GCL 是 GSH 合成的限速酶，GSH 對 GCL 有反饋抑製作用。GCL基因表達受多種因素調節，如氧化劑、抗氧化劑、生長因子和炎症因子等。GCL活性高低對GSH含量和GSH/GSSG比值有重要影響。

測定原理：

在ATP和Mg2+存在下，GCL催化穀氨酸和半胱氨酸合成γ-穀氨酰半胱氨酸；同時ATP去磷酸化產(chan) 生無機磷分子，通過測定無機磷增加速率，即可計算出GCL活性。

自備儀(yi) 器和用品：

冷凍離心機、水浴鍋、移液器、可見分光光度計/酶標儀(yi) 、微量玻璃比色皿/96孔板、濃硫酸和蒸餾水。

試劑組成和配製：

試劑一：液體(ti) 105mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。臨(lin) 用前加6 mL蒸餾水充分震蕩溶解。

試劑三：粉劑×1管，4℃保存。臨(lin) 用前加入蒸餾水1.5 mL充分震蕩溶解。

試劑四：液體(ti) 7mL×1瓶，室溫保存。

試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存。臨(lin) 用前加入12 mL蒸餾水，充分震蕩溶解後，緩緩加入400µL濃硫酸（自備），邊加邊攪拌。

粗酶液提取：

1. 組織：按照組織質量（g）：試劑一體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2. 細菌、真菌：按照細胞數量（104個(ge) ）：試劑一體(ti) 積（mL）為(wei) 500~1000：1的比例（建議500萬(wan) 細胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然後8000g，4℃，離心10min，取上清置於(yu) 冰上待測。

3. 血清等液體(ti) ：直接測定。

GCL測定操作：

1. 分光光度計/酶標儀(yi) 預熱30min，調節波長到660nm，蒸餾水調零。

2. 空白管：取1.5mLEp管，依次加入試劑一48µL、試劑二52µL、試劑三12µL和蒸餾水24µL，混勻後蓋緊，37℃水浴準確反應15 min；再加入試劑四60µL，混勻後，室溫（25℃左右）8000g，離心10 min，取上清100µL，加入試劑五100µL，混勻後蓋緊，45℃水浴10min，冷卻後測定660nm處光吸收，記為(wei) A空白管。

3. 測定管：取1.5mLEp管，依次加入試劑一48µL、試劑二52µL、試劑三12µL和上清液24µL，混勻後蓋緊，37℃水浴準確反應15 min；再加入試劑四60µL，混勻後，室溫（25℃左右）8000g，離心10 min，取上清100µL，加入試劑五100µL，混勻後蓋緊，45℃水浴10min，冷卻後測定660nm處光吸收，記為(wei) A測定管。

注意：空白管隻需要測定一次。

GCL活性計算公式：

標準曲線：y=0.1427x，R2=0.9987

a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義(yi) ：37℃下，每毫克蛋白每分鍾催化產(chan) 生1μg無機磷的GCL酶活量為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

GCL（μg/min /mg prot）=[（A測定管-A空白管）÷0.1427×V反總]÷(Cpr×V樣)÷T

=3.815×（A測定管-A空白管）÷Cpr

（2）按樣本質量計算

活性單位定義(yi) ：37℃下，每克組織每分鍾催化產(chan) 生1μg無機磷的GCL酶活量為(wei) 為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

GCL（μg/min /g 鮮重）= [（A測定管-A空白管）÷0.1427×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T

= 3.815×（A測定管-A空白管）÷W

（3）按細胞數量計算

活性單位定義(yi) ：37℃下，每104個(ge) 細胞每分鍾催化產(chan) 生1μg無機磷的GCL酶活量為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

GCL（μg/min /104 cell）=[（A測定管-A空白管）÷ 0.1427×V反總]÷(細胞數量×V樣÷V樣總)÷T

= 3.815×（A測定管-A空白管）÷細胞數量

（4）按照液體(ti) 體(ti) 積計算

活性單位定義(yi) ：37℃下，每毫升液體(ti) 每分鍾催化產(chan) 生1μg無機磷的GCL酶活量為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

GCL（μg/min /mL）=  [（A測定管-A空白管）÷ 0.1427×V反總]÷V樣÷T

=  3.815×（A測定管-A空白管）

0.1427：回歸方程係數；V反總：反應總體(ti) 積（mL）196 µL=0.196 mL；Cpr：上清液蛋白質濃度，mg/mL； V樣：加入反應體(ti) 係中上清液體(ti) 積，24µL =2.4×10-2 mL；V樣總：提取液體(ti) 積，1 mL；W：樣本質量，g；T：反應時間：15min。

b. 使用96孔板測定的計算公式如下

標準曲線：y=0.07135x，R2=0.9987

（(1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義(yi) ：37℃下，每毫克蛋白每分鍾催化產(chan) 生1μg無機磷的GCL酶活量為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

GCL（μg/min /mg prot）= [（A測定管-A空白管）÷0.07135×V反總]÷(Cpr×V樣)÷T

=7.63×（A測定管-A空白管）÷Cpr

（2）按樣本質量計算

活性單位定義(yi) ：37℃下，每克組織每分鍾催化產(chan) 生1μg無機磷的GCL酶活量為(wei) 為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

GCL（μg/min /g 鮮重）=  [（A測定管-A空白管）÷0.07135×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T

= 7.63×（A測定管-A空白管）÷W

（3）按細胞數量計算

活性單位定義(yi) ：37℃下，每104個(ge) 細胞每分鍾催化產(chan) 生1μg無機磷的GCL酶活量為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

GCL（μg/min /104 cell）=[（A測定管-A空白管）÷0.07135×V反總]÷(細胞數量×V樣÷V樣總)÷T

= 7.63×（A測定管-A空白管）÷細胞數量

（4）按照液體(ti) 體(ti) 積計算

活性單位定義(yi) ：37℃下，每毫升液體(ti) 每分鍾催化產(chan) 生1μg無機磷的GCL酶活量為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

GCL（μg/min /mL）= [（A測定管-A空白管）÷0.07135×V反總]÷V樣÷T

=7.63×（A測定管-A空白管）

0.07135：回歸方程係數；V反總：反應總體(ti) 積（mL）196 µL=0.196 mL；Cpr：上清液蛋白質濃度，mg/mL； V樣：加入反應體(ti) 係中上清液體(ti) 積，24µL =2.4×10-2 mL；V樣總：提取液體(ti) 積，1 mL；T：反應時間：15min。

注意事項：

（1）樣品處理等過程均需要在冰上進行，且須在當日測定酶活力，以免影響其活力。如果是勻漿液，避免反複凍融。

（2）所有試劑配製完後，除表明4℃保存外，請於(yu) 1天內(nei) 用完。

（3）實驗過程請帶手套，試劑三中有強腐蝕性物質，注意不要濺到皮膚上或眼睛內(nei) 。

（4）測定吸光值時請於(yu) 水浴後10～40分鍾內(nei) 測完。

（5）樣本測定前先取1-2個(ge) 樣做預實驗，如吸光值太高，應先用試劑一(或者生理鹽水)稀釋到適當倍數，使得吸光值在標準曲線範圍內(nei) ，哺乳動物組織和血液一般稀釋3～5倍。

（6）試劑三配製過程中，可能會(hui) 產(chan) 生黑色固體(ti) ，其不影響結果，注意吸取時不要將黑色固體(ti) 吸入。

（7）細胞中GCL活性測定時，細胞數目須在300萬(wan) -500萬(wan) 之間，細胞中GCL的提取時可加試劑一（或生理鹽水）後研磨或超聲波處理，不能用細胞裂解液處理細胞；

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