γ穀氨酰轉肽酶(γGT)測定（比色法）測試盒

γ穀氨酰轉肽酶(γGT)測定（比色法）測試盒

注意：正式測定之前選擇2-3個(ge) 預期差異大的樣本做預測定。

測定意義(yi) ：

γ-GT是γ-穀氨酰循環中的關(guan) 鍵酶，催化GSH降解。γ-GT催化GSH或者其他γ-穀氨酰基化合物上的γ-穀氨酰基轉移到受體(ti) 。也可以催化GSH和其他γ-穀氨酰基化合物的水解，產(chan) 生穀氨酸鹽，在細胞外穀胱甘肽新陳代謝中起了重要的作用。

測定原理：

γ-GT催化穀氨酰對硝基苯胺中γ-穀氨酰基轉移給N-甘氨酰甘氨酸，生成對硝基苯胺，在405nm有特征光吸收；通過測定405nm光吸收增加速率，來計算γ-GT酶活性。

自備儀(yi) 器和用品：

低溫離心機、水浴鍋、可調節移液器、可見分光光度計/酶標儀(yi) 、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸餾水

試劑組成和配製：

試劑一：液體(ti) 100mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。

試劑三：液體(ti) 4mL×1瓶，4℃保存。

試劑四：液體(ti) 14.8mL×1瓶，4℃保存。

工作液（在試劑二瓶中配製）：臨(lin) 用前配製，把試劑三倒入試劑二瓶中，充分溶解（室溫過低時可以40℃水浴促進溶解）；然後把試劑四倒入試劑二瓶中，混勻後室溫保存。

粗酶液提取：

1. 組織：按照組織質量（g）：試劑一體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心15min，取上清，置冰上待測。

2. 細菌、真菌：按照細胞數量（104個(ge) ）：試劑一體(ti) 積（mL）為(wei) 500~1000：1的比例（建議500萬(wan) 細胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然後8000g，4℃，離心15min，取上清置於(yu) 冰上待測。

3. 血清等液體(ti) ：直接測定。

γ-GT測定操作:

1. 分光光度計/酶標儀(yi) 預熱30min，調節波長到405 nm，蒸餾水調零。

2. 試劑二置於(yu) 25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動物）水浴中預熱30min（保證無沉澱）。

3. 測定管：取微量玻璃比色皿或96孔板，依次加入20μL上清液，180μL工作液，混勻後於(yu) 405nm測定10s和70s時吸光度，記為(wei) A1和A2。

γ-GT活性計算：

標準曲線：y=0.006x+0.0016，x為(wei) 對硝基苯胺濃度，y為(wei) 吸光值，R2=0.999。

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義(yi) ：25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分鍾催化產(chan) 生1μmol對硝基苯胺為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

γ-GT（μmol/min/mg prot）=[ (A2－A1)－0.0016]÷0.006×V反總÷（Cpr×V樣）÷T

=1.67 × [ (A2－A1)－0.0016] ÷ Cpr

(2). 按樣本質量計算

活性單位定義(yi) ：25℃或者37℃中，每克樣本每分鍾催化產(chan) 生1μmol對硝基苯胺為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

γ-GT（μmol/min/g 鮮重）=[ (A2－A1)－0.0016]÷0.006×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=1.67 × [ (A2－A1)－0.0016] ÷W

（3）按細胞數量計算

活性單位定義(yi) ：25℃或者37℃中，每104個(ge) 細胞每分鍾催化產(chan) 生1μmol對硝基苯胺為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

γ-GT（μmol/min/104 cell）=[ (A2－A1)－0.0016]÷0.006×V反總÷(細胞數量×V樣÷V樣總)÷T

=1.67 × [ (A2－A1)－0.0016] ÷細胞數量

（4）按液體(ti) 體(ti) 積計算

活性單位定義(yi) ：25℃或者37℃中，每毫升液體(ti) 每分鍾催化產(chan) 生1μmol對硝基苯胺為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

γ-GT（μmol/min/mL）= [ (A2－A1)－0.0016]÷0.006×V反總÷V樣÷T

= 1.67 × [ (A2－A1)－0.0016]

V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積（L），200μL=2×10-4L；Cpr：蛋白濃度（mg/mL）；W ：樣品質量；V樣：反應體(ti) 係中加入上清液體(ti) 積（mL），20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體(ti) 積，1 mL；T：反應時間（min），1min。

b.使用96孔板測定的計算公式如下

標準曲線：y=0.003x+0.0016，x為(wei) 對硝基苯胺濃度，y為(wei) 吸光值，R2=0.999。

(1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義(yi) ：25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分鍾催化產(chan) 生1μmol對硝基苯胺為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

γ-GT（μmol/min/mg prot）=[ (A2－A1)－0.0016]÷0.003×V反總÷（Cpr×V樣）÷T

=3.34× [ (A2－A1)－0.0016] ÷ Cpr

(2). 按樣本質量計算

活性單位定義(yi) ：25℃或者37℃中，每克樣本每分鍾催化產(chan) 生1μmol對硝基苯胺為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

γ-GT（μmol/min/g 鮮重）=[ (A2－A1)－0.0016]÷0.003×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=3.34 × [ (A2－A1)－0.0016] ÷W

（3）按細胞數量計算

活性單位定義(yi) ：25℃或者37℃中，每104個(ge) 細胞每分鍾催化產(chan) 生1μmol對硝基苯胺為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

γ-GT（μmol/min/104 cell）=[ (A2－A1)－0.0016]÷0.003×V反總÷(細胞數量×V樣÷V樣總)÷T

=3.34 × [ (A2－A1)－0.0016] ÷細胞數量

（4）按液體(ti) 體(ti) 積計算

活性單位定義(yi) ：25℃或者37℃中，每毫升液體(ti) 每分鍾催化產(chan) 生1μmol對硝基苯胺為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

γ-GT（μmol/min/mL）= [ (A2－A1)－0.0016]÷0.003×V反總÷V樣÷T

= 3.34 × [ (A2－A1)－0.0016]

V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積（L），200μL=2×10-4L；Cpr：蛋白濃度（mg/mL）；W ：樣品質量，g；V樣：反應體(ti) 係中加入上清液體(ti) 積（mL），20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體(ti) 積，1 mL；T：反應時間（min），1min。

注意事項：

培養(yang) 細胞中γ-GT活性測定時，細胞數目須在300萬(wan) -500萬(wan) 之間，細胞中γ-GT的提取時可加試劑一後研磨或超聲波處理，不能用細胞裂解液處理細胞（防止因為(wei) 蛋白質變性導致酶失活）。

配置好的工作液2周內(nei) 使用完畢。

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