NADP-蘋果酸脫氫酶（NADP-MDH）試劑盒

NADP-蘋果酸脫氫酶（NADP-MDH）試劑盒

正式測定前務必取2-3個(ge) 預期差異較大的樣本做預測定

測定意義(yi) ：

MDH （EC 1.1.1.37）廣泛存在於(yu) 動物、植物、微生物和培養(yang) 細胞中，線粒體(ti) 中MDH是TCA循環的關(guan) 鍵酶之一，催化蘋果酸形成草酰乙酸；相反，胞漿中MDH催化草酰乙酸形成蘋果酸。草酰乙酸是重要的中間產(chan) 物， 連接多條重要的代謝途徑。因此，MDH在細胞多種生理活動中扮演著重要的角色，包括線粒體(ti) 的能量代謝、 蘋果酸-天冬氨酸穿梭係統、活性氧代謝和抗病性等。根據不同的輔酶特異性，MDH分為(wei) NAD-依賴的MDH和NADP-依賴的MDH， NADP-MDH主要存在於(yu) 真核細胞中。

測定原理：

NADP-MDH催化NADPH還原草酰乙酸生成蘋果酸，導致340nm處光吸收下降。

需自備的儀(yi) 器和用品：

紫外分光光度計/酶標儀(yi) 、台式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。

試劑的組成和配製：

試劑一、提取液100 mL×1瓶，在4℃保存；

試劑二、液體(ti) 20 mL×1瓶，在4℃保存；

試劑三、粉劑×1瓶，-20℃保存；

樣本測定的準備：

1、細菌、細胞或組織樣品的製備：

細菌或培養(yang) 細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nei) ，離心後棄上清；按照細菌或細胞數量（104個(ge) ）：試劑一體(ti) 積（mL）為(wei) 500~1000：1的比例（建議500萬(wan) 細菌或細胞加入1mL試劑一），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重複30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質量（g）：試劑一體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1. 分光光度計或酶標儀(yi) 預熱30min以上，調節波長至340nm，蒸餾水調零。

2、檢測工作液的配製：用時在試劑三中加入19mL試劑二和0.5mL蒸餾水，充分混勻待用；用不完的試劑分裝後-20℃保存，禁止反複凍融；

3、測定前將檢測工作液在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴10min以上。

4、在微量石英比色皿或96孔板中加入5μL樣本和195μL工作液，混勻後立即記錄340nm處20s時的吸光值A1和 1min20s後的吸光值A2，計算ΔA=A1-A2。

注意：若A1-A2大於(yu) 0.5，需將酶液用提取液稀釋，使A1-A2小於(yu) 0.5，可提高檢測靈敏度。計算公式中乘以相應稀釋倍數。

NADP-MDH活力單位的計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、血清（漿）NADP-MDH活力的計算

單位的定義(yi) ：每毫升血清（漿）每分鍾消耗1 nmol的NADPH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

NADP-MDH（nmol/min/mL）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=6430×ΔA

2、組織、細菌或細胞中NADP-MDH活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義(yi) ：每mg組織蛋白每分鍾消耗1 nmol的NADPH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

NADP-MDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義(yi) ：每g組織每分鍾消耗1 nmol的NADPH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

NADP-MDH（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（W ×V樣÷V樣總）÷T =6430×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義(yi) ：每1萬(wan) 個(ge) 細菌或細胞每分鍾消耗1 nmol的NADPH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

NADP-MDH（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（V樣÷V樣總×500）÷T=12.86×ΔA

V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，2×10-4 L；ε：NADPH摩爾消光係數，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體(ti) 積，0.005 mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，1 mL；T：反應時間，1 min；W：樣本質量，g；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；500：細胞或細菌總數，500萬(wan) 。

b.用96孔板測定的計算公式如下

1、血清（漿）NADP-MDH活力的計算

單位的定義(yi) ：每毫升血清（漿）每分鍾消耗1 nmol的NADPH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

NADP-MDH（nmol/min/mL）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=12860×ΔA

2、組織、細菌或細胞中NADP-MDH活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義(yi) ：每mg組織蛋白每分鍾消耗1 nmol的NADPH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

NADP-MDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=12860×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義(yi) ：每g組織每分鍾消耗1 nmol的NADPH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

NADP-MDH（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（W× V樣÷V樣總）÷T =12860×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義(yi) ：每1萬(wan) 個(ge) 細菌或細胞每分鍾消耗1 nmol的NADPH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

NADP-MDH（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=25.72×ΔAV反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，2×10-4 L；ε：NADPH摩爾消光係數，6.22×103 L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體(ti) 積，0.005 mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，1 mL；T：反應時間，1 min；W：樣本質量，g；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；500：細胞或細菌總數，500萬(wan) 。

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