海藻糖酶測試盒

海藻糖酶測試盒

微量法 100管/48樣

正式測定前務必取2-3個(ge) 預期差異較大的樣本做預測定

測定意義(yi) ：

THL（EC 3.2.1.28）廣泛存在於(yu) 動物、植物、微生物和培養(yang) 細胞中。海藻糖酶主要功能在於(yu) 生物體(ti) 分解海藻糖生成葡萄糖而直接用於(yu) 能量供應。

測定原理：

THL催化海藻糖產(chan) 生葡萄糖，葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，並產(chan) 生過氧化氫；過氧化物酶催化過氧化氫氧化4-氨基安替比林偶聯酚，生成有色化合物，在505 nm有特征吸收峰，以此反映THL活性。

需自備的儀(yi) 器和用品：

可見分光光度計/酶標儀(yi) 、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配製：

提取液：液體(ti) 60mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體(ti) 6mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：液體(ti) 10ml×1瓶，4℃保存；

試劑三：液體(ti) 10ml×1瓶，4℃保存；（若出現結冰現象，可37℃水浴溶解後使用）

樣品測定的準備：

1、細菌或細胞的處理：收集細菌或細胞到離心管內(nei) ，離心後棄上清；按照細菌或細胞數量（104個(ge) ）：提取液體(ti) 積（mL）為(wei) 500~1000：1的比例（建議500萬(wan) 細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3S，間隔10S，重複30次）；8000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、組織的處理：按照組織質量（g）：提取液體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），冰浴中勻漿。8000g ，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）的處理：按照血清（漿）體(ti) 積（mL）：提取液體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5~10的比例（建議取0.1mL血清（漿）加入1mL提取液），冰浴中勻漿。8000g ，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟

1. 分光光度計或酶標儀(yi) 預熱30min以上，調節波長至505nm，蒸餾水調零。

2. 調節水浴鍋至95度。

3. 工作液的配製：使用前將試劑二和試劑三1:1等體(ti) 積混合，用多少配多少。

4、加樣表：

45℃水浴，準確反應15min，95℃水浴5分鍾終止反應，得混合液(若出現沉澱可10000g

4℃離心10min後取上清)。

混勻，置37℃（哺乳動物）或25'C（其它物種）保溫15min後，於(yu) 505nm波長處讀取吸光度。計算ΔA=A測定管-A對照管。每個(ge) 測定管需設一個(ge) 對照管。

THL活力計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、標準條件下測定回歸方程為(wei) y = 0.4858x - 0.0042，R2 = 0.9999；x為(wei) 標準品濃度（μmol/mL），y為(wei) 吸光值。

2、按照蛋白濃度計算

單位的定義(yi) ：每mg組織蛋白每分鍾催化產(chan) 生1nmol 葡萄糖定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

THL活力(nmol/min/mg prot)=(ΔA+0.0042) ÷0.4858×V反總÷(V樣×Cpr)÷T×1000

=366× (ΔA+0.0042) ÷Cpr

3、按樣本鮮重計算

單位的定義(yi) ：每g組織每分鍾催化產(chan) 生1nmol 葡萄糖定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

THL活力(nmol/min/g 鮮重)=(ΔA+0.0042) ÷0.4858×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T×1000

=366×(ΔA+0.0042)÷W

4、按細菌或細胞密度計算

單位的定義(yi) ：每1萬(wan) 個(ge) 細菌或細胞每分鍾催化產(chan) 生1nmol 葡萄糖定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

THL活力(nmol/min/104 cell)=(ΔA+0.0042) ÷0.4858×V反總÷(500 ×V樣÷V樣總) ÷T×1000

=0.732×(ΔA+0.0042)

5、按血清（漿）體(ti) 積計算

單位的定義(yi) ：每mL血清（漿）每分鍾催化產(chan) 生1nmol 葡萄糖定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

THL活力(nmol/min/mL)=(ΔA+0.0042) ÷0.4858×V反總÷(V液 ×V樣÷V樣總) ÷T×1000

=3660×(ΔA+0.0042)

V樣：加入樣本體(ti) 積：0.03mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，1 mL；V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，0.08mL；V液：加入血清（漿）體(ti) 積，0.1mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500萬(wan) ；T：反應時間，15min；

b.用96孔板測定的計算公式如下

1、標準條件下測定回歸方程為(wei) y = 0.2429x - 0.0042，R2 = 0.9999；x為(wei) 標準品濃度（μmol/mL），y為(wei) 吸光值。

2、按照蛋白濃度計算

單位的定義(yi) ：每mg組織蛋白每分鍾催化產(chan) 生1nmol 葡萄糖定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

THL活力(nmol/min/mg prot)=(ΔA+0.0042) ÷0.2429×V反總÷(V樣×Cpr)÷T×1000

=732× (ΔA+0.0042) ÷Cpr

3、按樣本鮮重計算

單位的定義(yi) ：每g組織每分鍾催化產(chan) 生1nmol 葡萄糖定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

THL活力(nmol/min/g 鮮重)=(ΔA+0.0042) ÷0.2429×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T×1000

=732×(ΔA+0.0042)÷W

4、按細菌或細胞密度計算

單位的定義(yi) ：每1萬(wan) 個(ge) 細菌或細胞每分鍾催化產(chan) 生1nmol 葡萄糖定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

THL活力(nmol/min/104 cell)=(ΔA+0.0042) ÷0.2429×V反總÷(500 ×V樣÷V樣總) ÷T×1000

=1.464×(ΔA+0.0042)

5、按血清（漿）體(ti) 積計算

單位的定義(yi) ：每mL血清（漿）每分鍾催化產(chan) 生1nmol 葡萄糖定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

THL活力(nmol/min/mL)=(ΔA+0.0042) ÷0.2429×V反總÷(V液 ×V樣÷V樣總) ÷T×1000

=7320×(ΔA+0.0042)

V樣：加入樣本體(ti) 積：0.03mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，1 mL；V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，0.08mL；V液：加入血清（漿）體(ti) 積，0.1mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500萬(wan) ；T：反應時間，15min；

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