遊離脂肪酸含量（FFA）測試盒

遊離脂肪酸含量（FFA）測試盒

微量法100管/96樣

正式測定前務必取2-3個(ge) 預期差異較大的樣本做預測定

測定意義(yi) ：

遊離脂肪酸，也稱為(wei) 非酯化脂肪酸，在與(yu) 白蛋白結合的血漿中循環。動物血液中的遊離脂肪酸 (FFA )含量是一項重要的生理生化指標。血清中遊離脂肪酸的濃度與(yu) 脂類代謝、糖代謝、內(nei) 分泌功能有關(guan) ，遊離脂肪酸的濃度會(hui) 因為(wei) 糖尿病、重症肝障礙、甲狀腺功能亢進等疾病而上升。

測定原理：

用有機溶劑萃取FFA。含有FFA的有機液與(yu) 三乙醇胺銅反應,在有機相中形成脂肪酸銅 (銅皂) FFA一Cu。Cu離子與(yu) 顯色液反應形成紫紅色絡合物。反應形成的顏色深淺與(yu) Cu離子濃度的關(guan) 係符合朗伯一比爾定律，因此可利用此反應進行比色。

自備的儀(yi) 器和用品：

酶標儀(yi) 、離心機、可調式移液器、96孔板、蒸餾水。

試劑的組成和配製：

萃取液：液體(ti) 120 mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體(ti) 15 mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：液體(ti) 15 mL×1瓶，4℃保存；

試劑三：粉劑×1瓶，室溫保存；

試劑四：液體(ti) 12 mL×1瓶，4℃保存；

樣本前處理：

1.動物組織：按照動物組織質量（g）：萃取液mL)為(wei) 1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL萃取液），進行冰浴勻漿。震蕩提取15min，5000 rpm 4℃離心5min，取有機相待測。

2.血清：吸取50 μL血清樣本，加入1 mL萃取液，震蕩提取15 min後，4℃，5000 rpm離心5 min，取有機相待測。

3.微生物、細胞：按照細胞數量（104個(ge) ）：萃取液體(ti) 積（mL）為(wei) 500~1000：1的比例（建議500萬(wan) 細胞加入1 mL萃取液）加入萃取液，冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲2秒，間隔3秒，總時間3min）；震蕩提取15 min，然後5000 rpm 4℃離心5min，取有機相待測。

注意：有機相待測液可能存在於(yu) 上層，也可能存在於(yu) 下層，注意觀察，體(ti) 積較多的那一層即為(wei) 有機相待測液。

測定步驟：

1. 酶標儀(yi) 預熱30min以上，調節波長至550 nm。

2. 工作液的配製：臨(lin) 用前根據用量按照試劑一（V）：試劑二（V）：試劑三（m）=1（mL）：1（mL）：0.66（g）的比例充分混勻。（注意：現用現配，用多少配多少，在空瓶中配製，試劑盒中帶有4個(ge) 空瓶，先將試劑一與(yu) 試劑二混合，最後再加入試劑三粉劑）

3、測定管：吸取600μL樣本，加入200μL工作液，蓋緊後震蕩20 min，4℃，5000 rpm離心5 min，分層後取200μL上層有機相，加入100μL試劑四，搖勻，10 min後測定550 nm的吸光值，記為(wei) A測定。

4、空白管：吸取600μL萃取液，加入200μL工作液，蓋緊後震蕩20 min，4℃，5000 rpm離心5 min，分層後取200μL上層有機相，加入100μL試劑四，搖勻，10 min後測定550 nm的吸光值，記為(wei) A空白。

空白管隻需測一次。△A=A測定-A空白

注意：1、有機溶劑易揮發，加入96孔板後應盡快檢測。

2、測定管中加入的樣本即樣本前處理中的有機相待測液。

FFA含量計算：

標準曲線：y = 0.0161x - 0.0141     R2 = 0.9985   x：棕櫚酸標準品濃度（nmol/mL）

y：吸光值差值△A

1、血清FFA含量計算：

FFA含量(μmol/mL)=(△A+0.0141)÷0.0161×V1÷(V3×V1÷V2)÷1000

=1.242×(△A+0.0141)

2、動物組織、微生物、細胞中FFA含量計算：

（1）按樣本蛋白濃度計算

FFA含量(μmol/g鮮重)=(△A+0.0141)÷0.0161×V1÷（W× V1÷V2）÷1000

=0.062×(△A+0.0141)÷W

（2）按樣本蛋白濃度計算

FFA含量(μmo/mg prot)= (△A+0.0141)÷0.0161×V1÷(V1×Cpr)÷1000

=0.062×(△A+0.0141)÷Cpr

V1：加入樣本體(ti) 積，0.6mL；V2：萃取液體(ti) 積，1mL；V3：加入血清（漿）體(ti) 積，0.05 mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：動物組織樣品質量，g； 1000：1 μmol=1000 nmol 。

注意事項：

蛋白含量不可直接用萃取液提取的有機相待測液直接測定，可用蒸餾水或緩衝(chong) 液或生理鹽水選用本公司的BCA法蛋白含量測定試劑盒。

*低檢出限為(wei) 20 nmol/mL。

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