甲醛脫氫酶（FDH）測試盒

甲醛脫氫酶（FDH）測試盒

微量法100T/96S

注意：正式測定之前選擇2-3個(ge) 預期差異大的樣本做預測定。

測定意義(yi)

甲醛是一種能與(yu) 蛋白質、核酸和脂類產(chan) 生非特異性反應的活潑化合物，對所有生物都具有很高毒性。甲醛脫氫酶作為(wei) 含鋅中等鏈醇脫氫酶（ADH）的家庭成員之一，廣泛存在於(yu) 原核和真核生物中，該酶能利用NAD+作為(wei) 輔酶，將有毒的甲醛氧化，是甲醛氧化途徑中的關(guan) 鍵酶。

測定原理

甲醛脫氫酶催化甲醛和NAD+產(chan) 生NADH，在340nm處的吸光值會(hui) 增加，測定340nm處的吸光值變化，可計算得到甲醛脫氫酶的活性。

自備實驗用品及儀(yi) 器

天平、離心機、酶標儀(yi) 、96孔板、蒸餾水。

試劑組成和配製

提取液：液體(ti) 100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體(ti) 15mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨(lin) 用前加入6mL水溶解待用，用不完的試劑分裝後-20℃保存，禁止反複凍融。

試劑三：粉劑×1支，4℃保存；臨(lin) 用前加入1.5mL水溶解待用。

試劑四：液體(ti) 1.5mL×1支，4℃避光保存。

FDH提取

1. 組織：按照組織質量（g）：提取液體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進行冰浴勻漿，然後10000g，4℃，離心20min。

2. 細胞：按照細胞數量（104個(ge) ）：提取液體(ti) 積（mL）為(wei) 500~1000：1的比例（建議500萬(wan) 細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然後10000g，4℃，離心10min，取上清置於(yu) 冰上待測。

3. 液體(ti) ：直接檢測。

測定操作表

1. 酶標儀(yi) 預熱30min，調節波長至340nm。

2. 操作表

在96孔板中加入如下試劑

混勻，於(yu) 340nm下測定初始吸光值A1與(yu) 5min後的吸光值A2，△A=A2-A1。

若樣本數量較多，可將試劑按比例配成工作液使用。

FDH酶活計算

（1）按蛋白濃度計算

酶活定義(yi) ：每毫克蛋白每分鍾催化還原1nmol NAD+的酶量為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

FDH酶活（nmol/min/mg prot）= ×V反總÷（V樣×Cpr）÷T = 643×△A÷Cpr

（2）按樣本質量計算

酶活定義(yi) ：每克樣品每分鍾催化還原1nmol NAD+的酶量為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

FDH酶活（nmol/min/g 鮮重）= ×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T =643×△A÷W

（3）按照細胞數量計算

酶活定義(yi) ：每104個(ge) 細胞每分鍾催化還原1nmol NAD+的酶量為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

FDH酶活（nmol/min/104cell）= ×V反總÷（V樣÷V樣總×細胞數量（萬(wan) 個(ge) ））÷T= 643×△A÷細胞數量

（4）按液體(ti) 體(ti) 積計算

酶活定義(yi) ：每mL樣本每分鍾催化還原1nmol NAD+的酶量為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

FDH酶活（nmol/min/mL）= ×V反總÷V樣÷T=643×△A

：NADH微摩爾消光係數，6.22×10-3 L/µmol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，0.2mL；V樣：反應體(ti) 係中樣本體(ti) 積，0.02mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，1mL；T，反應時間，5min；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g

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