糖原磷酸化酶a（GPa）測試盒

糖原磷酸化酶a（GPa）測試盒

微量法 100管/96樣

正式測定前務必取2-3個(ge) 預期差異較大的樣本做預測定

測定意義(yi) ：

糖原磷酸化酶（Glycogen phosphorylase，GP，EC 2.4.1.1)）是糖原分解代謝的關(guan) 鍵酶，使糖原分子從(cong) 非還原端逐個(ge) 斷開α-1，4-糖苷鍵移去葡萄糖基，釋放1-磷酸葡萄糖，直至臨(lin) 近糖原分子α-1，6-糖苷鍵分支點前4個(ge) 葡萄糖基處。GP分為(wei) 有活性的糖原磷酸化酶a（GPa）和無活性的糖原磷酸化酶b（GPb）兩(liang) 種形式。糖原的分解主要在GPa的催化下進行。

測定原理：

未添加激活劑時，GPa催化糖原和無機磷產(chan) 生葡萄糖殘基生成糖原和1-磷酸葡萄糖，磷酸葡萄糖變位酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶進一步依次催化NADP還原生成NADPH，在340nm下測定NADPH上升速率，即可反映GPa活性。

需自備的儀(yi) 器和用品：

紫外分光光度計/酶標儀(yi) 、台式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配製：

提取液：100mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體(ti) 16 mL×1瓶， 4℃保存；

試劑二：粉劑×1瓶，-20℃保存；

試劑三：粉劑×1支，-20℃保存；

試劑四：粉劑×1支， -20℃保存；

樣本的前處理：

按照組織質量（g）：提取液體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1. 分光光度計或酶標儀(yi) 預熱30min以上，調節波長至340nm，蒸餾水調零；

2. 工作液的配製：臨(lin) 用前將試劑二轉移到試劑一中混合溶解待用；用不完的試劑分裝後-20℃保存，禁止反複凍融。

3. 試劑三的配製：臨(lin) 用前在試劑三管中加入1mL蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝後-20℃保存，禁止反複凍融。

4. 試劑四的配製：臨(lin) 用前在試劑四管中加入1mL蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝後-20℃保存，禁止反複凍融。

5. 將工作液、試劑三和試劑四置於(yu) 37℃預熱5分鍾；

6. 在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑三、10μL試劑四、10μL蒸餾水和160μL工作液，立即混勻，記錄340nm處5min後的A1和10min後的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1。

GPa活性計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下：

（1）按樣本蛋白濃度計算

單位定義(yi) ：每mg組織蛋白每分鍾產(chan) 生1nmol NADPH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

GPa（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位定義(yi) ：每g組織每分鍾產(chan) 生1nmol NADPH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

GPa（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=643×ΔA÷W

V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，2×10-4 L；ε：NADPH摩爾消光係數，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體(ti) 積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，1 mL；T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g。

b.用96孔板測定的計算公式如下：

（1）按樣本蛋白濃度計算

單位定義(yi) ：每mg組織蛋白每分鍾產(chan) 生1nmol NADPH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

GPa（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位定義(yi) ：每g組織每分鍾產(chan) 生1nmol NADPH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

GPa（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=1286×ΔA÷W

V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，2×10-4 L；ε：NADPH摩爾消光係數，6.22×103 L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體(ti) 積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，1 mL；T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g。

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