錳過氧化物酶（MnP）測試盒

錳過氧化物酶（MnP）測試盒

微量法100T/96S

注意：正式測定之前選擇2-3個(ge) 預期差異大的樣本做預測定。

測定意義(yi)

錳過氧化物酶（EC1.11.1.13）是一種含亞(ya) 鐵血紅素的過氧化物酶，主要存在於(yu) 擔子菌中，屬於(yu) 木質素降解酶係，能有效的降解木質素及廢水和土壤中比較難降解的氯化物，疊氮化合物、DTT，多環芳烴等。

測定原理

錳過氧化物酶在Mn2+存在的條件下，將愈創木酚氧化為(wei) 四鄰甲氧基連酚，在465nm有特征吸收峰。

自備實驗用品及儀(yi) 器

天平、研缽、低溫離心機、可見分光光度計/酶標儀(yi) 、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋。

試劑組成和配製                 

試劑一：液體(ti) 110mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體(ti) 2mL×1支，4℃保存。

試劑三：液體(ti) 5mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑四：液體(ti) 2mL×1支，4℃保存。

酶液提取

1. 組織：按照質量（g）：試劑一體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL試劑一）加入試劑一，冰浴勻漿後於(yu) 4℃，10000g離心10min，取上清置於(yu) 冰上待測。

2. 細胞：按照細胞數量（104個(ge) ）：試劑一體(ti) 積（mL）為(wei) 500~1000：1的比例（建議500萬(wan) 細胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然後4℃，10000g離心10min，取上清置於(yu) 冰上待測。

3. 培養(yang) 液或其它液體(ti) ：直接檢測。                         

測定操作

1. 分光光度計或酶標儀(yi) 預熱30min以上，調節波長至465nm，蒸餾水調零。

2. 測定前將試劑一、二、三、四在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）放置10min以上。

3. 樣本測定表

在微量石英比色皿或96孔板中按順序加入上述試劑，立即混勻並計時，記錄465nm下30s時的吸光值A1和2min30s後的吸光值A2。計算ΔA＝A2-A1。

注意：若一次性測定樣本較多，可將試劑一、二、三、四按比例配成混合液，在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）放置10min以上，測定時加入20µL樣本和180µL混合液測定。

酶活計算公式

1. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1．按照蛋白濃度計算

酶活性定義(yi) ：每毫克蛋白每分鍾氧化1nmol愈創木酚所需的酶量為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

MnP活性（nmol/min/mg prot）= [ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=413×ΔA÷Cpr

2．按照樣本質量計算

酶活性定義(yi) ：每克樣品每分鍾氧化1nmol愈創木酚所需的酶量為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

MnP活性（nmol/min/g 鮮重）= [ΔA×V反總÷（ε×d）×109] ÷（V樣×W÷V樣總）÷T= 413×ΔA÷W

3．按照細胞數量計算

酶活性定義(yi) ：每104個(ge) 細胞每分鍾氧化1nmol愈創木酚所需的酶量為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

MnP活性（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109] ÷（V樣×細胞數量÷V樣總）÷T

= 413×ΔA÷細胞數量

4．按照液體(ti) 體(ti) 積計算

酶活性定義(yi) ：每毫升培養(yang) 液每分鍾氧化1nmol愈創木酚所需的酶量為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

MnP活性（nmol/min/mL）= [ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T= 413×ΔA

ε：愈創木酚摩爾消光係數：12100L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應總體(ti) 積，2×10-4 L；V樣：反應中樣本體(ti) 積，0.02mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；T：反應時間，2min

2. 用96孔板測定的計算公式如下

1．按照蛋白濃度計算

酶活性定義(yi) ：每毫克蛋白每分鍾氧化1nmol愈創木酚所需的酶量為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

MnP活性（nmol/min/mg prot）= [ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=826×ΔA÷Cpr

2．按照樣本質量計算

酶活性定義(yi) ：每克樣品每分鍾氧化1nmol愈創木酚所需的酶量為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

MnP活性（nmol/min/g 鮮重）= [ΔA×V反總÷（ε×d）×109] ÷（V樣×W÷V樣總）÷T= 826×ΔA÷W

3．按照細胞數量計算

酶活性定義(yi) ：每104個(ge) 細胞每分鍾氧化1nmol愈創木酚所需的酶量為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

MnP活性（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109] ÷（V樣×細胞數量÷V樣總）÷T

= 826×ΔA÷細胞數量

4．按照液體(ti) 體(ti) 積計算

酶活性定義(yi) ：每毫升培養(yang) 液每分鍾氧化1nmol愈創木酚所需的酶量為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

MnP活性（nmol/min/mL）= [ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T= 826×ΔA

ε：愈創木酚摩爾消光係數：12100L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V反總：反應總體(ti) 積，2×10-4 L；V樣：反應中樣本體(ti) 積，0.02mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；T：反應時間，2min

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