酰基轉移酶（AAT）測試盒

酰基轉移酶（AAT）測試盒

微量法 100管/96樣

注意：正式測定之前選擇2-3個(ge) 預期差異大的樣本做預測定。

測定意義(yi) ：

AAT是一個(ge) 多功能蛋白大家族，主要負責催化生物體(ti) 內(nei) 各種酰基化和去酰基化反應，在基因表達、代謝和信號傳(chuan) 導中具有重要作用。

測定原理：

AAT催化乙酰CoA轉移乙酰基到丁醇，釋放的CoA還原DTNB生成TNB；TNB在412nm有吸收峰，測定412 nm吸光度增加速率可計算AAT活性。

自備儀(yi) 器和用品：

研缽、冰、台式離心機、可見分光光度計/酶標儀(yi) 、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋、無水乙醇。

試劑組成和配製：

提取液：液體(ti) 100mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體(ti) 20mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1瓶，-20℃保存。

試劑三：粉劑×1支，4℃避光保存。

粗酶液提取：

1. 組織：按照組織質量（g）：提取液體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。

2. 細菌、真菌：按照細胞數量（104個(ge) ）：提取液體(ti) 積（mL）為(wei) 500~1000：1的比例（建議500萬(wan) 細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然後8000g，4℃，離心10min，取上清置於(yu) 冰上待測。

3. 液體(ti) ：直接檢測。

AAT測定操作：

1、分光光度計/酶標儀(yi) 預熱30min，調節波長到412 nm，蒸餾水調零。

2、工作液的配製：臨(lin) 用前在試劑二瓶中加入18mL試劑一，充分混勻待用。用不完的試劑分裝後-20℃保存，禁止反複凍融。

3、試劑三的配製：臨(lin) 用前加無水乙醇1mL充分溶解待用，用不完的試劑4℃保存。

4、 空白管：在Ep管或96孔板中加入10μL提取液和180μL工作液，充分混勻，35℃反應15min，加入10μL試劑三，充分混勻，25℃靜置10min，測定412nm處吸光值，記為(wei) A空白管。

5、 測定管：在Ep管或96孔板中加入10μL樣本和180μL工作液，充分混勻，35℃反應15min，加入10μL試劑三，充分混勻，25℃靜置10min，測定412nm處吸光值，記為(wei) A測定管。△A=A測定管- A空白管，空白管隻要做一管。

AAT活性計算：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按照蛋白濃度計算

活性單位定義(yi) ：每毫克蛋白每分鍾催化產(chan) 生1nmol TNB定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活單位。

AAT (nmol/min/mg prot) = △A ÷（×d）×V反總÷（V樣×Cpr）÷T = 98.04×△A÷Cpr

（2）按照樣本質量計算

活性單位定義(yi) ：每克組織每分鍾催化產(chan) 生1nmol TNB定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活單位。

AAT (nmol/min /g 鮮重) = △A ÷（×d）×V反總÷(W×V樣÷V樣總) ÷T 

= 98.04×△A÷W

（3）按細胞數量計算

活性單位定義(yi) ：每104個(ge) 細胞每分鍾催化產(chan) 生1nmol TNB定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活單位。

AAT (nmol/min/104cell) = △A ÷（×d）×V反總÷(細胞數量×V樣÷V樣總) ÷T

= 98.04×△A÷ 細胞數量

（4）按液體(ti) 體(ti) 積計算

活性單位定義(yi) ：每毫升樣品每分鍾催化產(chan) 生1nmol TNB定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活單位。

AAT (nmol/min/mL) = △A ÷（×d）×V反總÷V樣÷T

 = 98.04×△A

：TNB消光係數，13600L/mol/cm；d：比色皿光徑：1cm；V反總：反應總體(ti) 積，0.2mL；V樣：加入反應體(ti) 係中上清液體(ti) 積，0.01mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，1mL；Cpr：蛋白含量，mg/mL；W：樣本質量，g；T：反應時間，15 min。

b.使用96孔板測定的計算公式如下

（1）按照蛋白濃度計算

活性單位定義(yi) ：每毫克蛋白每分鍾催化產(chan) 生1nmol TNB定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活單位。

AAT (nmol/min/mg prot) = △A ÷（×d）×V反總÷（V樣×Cpr）÷T 

=196.08×△A÷Cpr

（2）按照樣本質量計算

活性單位定義(yi) ：每克組織每分鍾催化產(chan) 生1nmol TNB定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活單位。

AAT (nmol/min /g 鮮重) = △A ÷（×d）×V反總÷(W×V樣÷V樣總) ÷T 

= 196.08×△A÷W

（3）按細胞數量計算

活性單位定義(yi) ：每104個(ge) 細胞每分鍾催化產(chan) 生1nmol TNB定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活單位。

AAT (nmol/min/104cell) = △A ÷（×d）×V反總÷(細胞數量×V樣÷V樣總) ÷T

=196.08×△A÷ 細胞數量

（4）按液體(ti) 體(ti) 積計算

活性單位定義(yi) ：每毫升樣品每分鍾催化產(chan) 生1nmol TNB定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活單位。

AAT (nmol/min/mL) = △A ÷（×d）×V反總÷V樣÷T

 = 196.08×△A

：TNB消光係數，13600L/mol/cm；d：96孔板光徑：0.5cm；V反總：反應總體(ti) 積，0.2mL；V樣：加入反應體(ti) 係中上清液體(ti) 積，0.01mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，1mL；Cpr：蛋白含量，mg/mL；W：樣本質量，g；T：反應時間，15min。

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