蛋白質羰基測試盒

蛋白質羰基測試盒

微量法100T/48S

注意：正式實驗之前選擇2-3個(ge) 預期差異大的樣本做預測定。

測定意義(yi) ：

蛋白質羰基是多種氨基酸在蛋白質的氧化修飾過程中的早期標誌，其含量高低表明蛋白質氧化損傷(shang) 程度的大小，是衡量蛋白質氧化損傷(shang) 的主要指標。

測定原理：

羰基與(yu) 2,4-二硝*苯肼反應生成紅色2,4-二硝*苯腙，在370nm處有特征吸收峰。

自備實驗用品及儀(yi) 器：

天平、恒溫水浴鍋、低溫離心機、漩渦震蕩儀(yi) 、可見分光光度計/酶標儀(yi) 、微量石英比色皿/96孔板、蒸餾水、無水乙醇、乙酸乙酯。

試劑組成和配製：

提取液：液體(ti) 100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：粉劑0.1g×5支，4℃避光保存。（使用前根據樣品數，每支加1mL水溶解，每支為(wei) 10個(ge) 樣品用量）

試劑二：液體(ti) 6mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑三：液體(ti) 6mL×1瓶，4℃保存。

試劑四：液體(ti) 15mL×1瓶，4℃保存。

試劑五：根據測定樣品量，將乙酸乙酯和無水乙醇等體(ti) 積混合。

試劑六：液體(ti) 60mL×1瓶，4℃保存。

樣品處理：

組織樣品：按照組織質量（g）：提取液體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進行冰浴勻漿，於(yu) 4℃，4000g離心10min，取上清，加入0.1mL試劑一，室溫放置10min，4℃，10000g離心10min，取上清待測。

細菌、真菌：按照細胞數量（104個(ge) ）：提取液體(ti) 積（mL）為(wei) 500~1000：1的比例（建議500萬(wan) 細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然後10000g，4℃，離心10min，取上清置於(yu) 冰上待測。

血清等液體(ti) 樣本：直接測定。

測定步驟和操作表：

1. 分光光度計/酶標儀(yi) 預熱30min，調節波長至370nm。

2. 操作表

計算公式：

a．用微量石英比色皿測定的計算公式如下

按照樣本蛋白濃度計算

蛋白質羰基含量（μmol/mg prot）= [ΔA370×V反總÷（ε×d）]÷(V樣×Cpr) =0.227×ΔA370÷Cpr

按照樣本重量計算

蛋白質羰基含量（μmol/g 鮮重）= [ΔA370×V反總÷（ε×d）]÷(W ×V樣÷V樣總) =0.227×ΔA370÷W

3. 按照細胞數量計算

蛋白質羰基含量（μmol/104cell）= [ΔA370×V反總÷（ε×d）]÷(細胞數量 ×V樣÷V樣總) =0.227×ΔA370÷細胞數量

按照液體(ti) 體(ti) 積計算

蛋白質羰基含量（μmol/mL）= [ΔA370×V反總÷（ε×d）]÷V樣=0.227×ΔA370

V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，0.3 mL；ε：羰基毫摩爾消光係數，22 L/mmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體(ti) 積，0.06 mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，1 mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL，W：樣本質量，g

2. 用96孔板測定的計算公式如下

1. 按照樣本蛋白濃度計算

蛋白質羰基含量（μmol/mg prot）= [ΔA370×V反總÷（ε×d）]÷(V樣×Cpr) =0.454×ΔA370÷Cpr

2. 按照樣本重量計算

蛋白質羰基含量（μmol/g 鮮重）= [ΔA370×V反總÷（ε×d）]÷(W ×V樣÷V樣總) =0.454×ΔA370÷W

3. 按照細胞數量計算

蛋白質羰基含量（μmol/104cell）= [ΔA370×V反總÷（ε×d）]÷(細胞數量 ×V樣÷V樣總) =0.454×ΔA370÷細胞數量

4. 按照液體(ti) 體(ti) 積計算

蛋白質羰基含量（μmol/mL）= [ΔA370×V反總÷（ε×d）]÷V樣=0.454×ΔA370

V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，0.3 mL；ε：羰基毫摩爾消光係數，22 L/mmol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體(ti) 積，0.06 mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，1 mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL，W：樣本質量，g

注意事項：

1. 試劑一使用前根據要測定的樣品數現配，配置好後4℃保存，若變為(wei) 黑色，則不能使用。

2. 試劑二見光易分解，反應需嚴(yan) 格避光。

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