脯氨酸（PRO）含量測試盒

脯氨酸（PRO）含量測試盒

微量法 100管/96樣

正式測定前務必取2-3個(ge) 預期差異較大的樣本做預測定

測定意義(yi) ：

Pro廣泛存在於(yu) 動物、植物、微生物和培養(yang) 細胞中，逆境條件下，植物體(ti) 內(nei) Pro含量顯著增加。Pro增加量在一定程度上反映了抗逆性，抗旱性強的品種往往積累較多的脯氨酸。因此，脯氨酸增加量可以作為(wei) 抗逆育種的生理指標之一。 

測定原理：

用磺基水楊酸（SA）提取Pro，加熱處理後，Pro與(yu) 酸性茚三酮溶液反應生成紅色；加甲苯萃取後，在520nm測定吸光度。

需自備的儀(yi) 器和用品：

可見分光光度計/酶標儀(yi) 、水浴鍋、台式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、冰乙酸25mL、甲苯50mL、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配製：

提取液：液體(ti) 100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：冰乙酸25 mL×1瓶， 4℃保存。（自備）

試劑二：液體(ti) 25 mL×1瓶， 4℃保存。

試劑三：甲苯50mL×1瓶，4℃保存。（自備）

樣品測定的準備： 

1、細菌、細胞或組織樣品的製備：

細菌或培養(yang) 細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nei) ，離心後棄上清；按照細菌或細胞數量（104個(ge) ）：提取液體(ti) 積（mL）為(wei) 500~1000：1的比例（建議500萬(wan) 細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重複30次）；之後置95℃水浴振蕩提取10min；10000g，25℃離心10min，取上清，冷卻後待測。

組織：按照組織質量（g）：提取液體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），勻漿；之後置95℃水浴振蕩提取10min；10000g，25℃離心10min，取上清，冷卻後待測。

2、血清（漿）樣品：按照血清（漿）體(ti) 積（mL）：提取液體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5~10的比例（建議取0.1mL血清（漿）加入1mL提取液），充分混勻，之後置95℃水浴振蕩提取10分鍾，10000g，25℃離心10分鍾，取上清，冷卻後待測。

測定步驟：

1. 分光光度計或酶標儀(yi) 預熱30min以上，調節波長至520nm，蒸餾水調零。

2. 樣本測定：

(1) 取0.25mL樣本+0.25mL試劑一+0.25mL試劑二 於(yu) 有蓋EP管中，置95℃水浴中保溫30min（蓋緊，防止水分散失），每10min振蕩一次。

(2) 待冷卻後，加入0.5mL試劑三，振蕩30s，靜置片刻，使色素轉至試劑三中；吸取0.2mL上層溶液於(yu) 微量石英比色皿或96孔板中，於(yu) 520nm波長處比色，記錄吸光值A。

Pro含量計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、典型回歸方程y = 0.0521x - 0.0021  (x為(wei) 脯氨酸含量，μg/mL；y為(wei) 吸光值A)

2、按照血清（漿）體(ti) 積計算

Pro含量(μg/mL)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(V3×V1÷V2）=192×(A+0.0021)

3、按照蛋白濃度計算

Pro含量(μg/mg prot)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(V1×Cpr)=19.2×(A+0.0021)÷Cpr

4、按照樣本質量計算

Pro含量(µg/g鮮重)= [(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(W×V1÷V2)=19.2×(A+0.0021) ÷W

5、按照細菌或細胞密度計算

Pro含量(μg/104 cell)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(500×V1÷V2)=0.0384×(A+0.0021)

V1：加入反應體(ti) 係中樣本體(ti) 積，0.25mL；V2：加入提取液體(ti) 積，1 mL；V3：加入血清（漿）體(ti) 積，0.1 mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500萬(wan) 。

b.用96孔板測定的計算公式如下

1、典型回歸方程y = 0.02605x - 0.0021  (x為(wei) 脯氨酸含量，μg/mL；y為(wei) 吸光值A)

2、按照血清（漿）體(ti) 積計算

Pro含量(μg/mL)=[(A+0.0021) ÷0.02605×V1]÷(V3×V1÷V2）=384×(A+0.0021)

3、按照蛋白濃度計算

Pro含量(μg/mg prot)=[(A+0.0021) ÷0.02605×V1]÷(V1×Cpr)=38.4×(A+0.0021)÷Cpr

4、按照樣本質量計算

Pro含量(µg/g鮮重)= [(A+0.0021) ÷0.02605×V1]÷(W×V1÷V2)=38.4×(A+0.0021) ÷W

3、按照細菌或細胞密度計算

Pro含量(μg/104 cell)=[(A+0.0021) ÷0.02605×V1]÷(500×V1÷V2)=0.0769×(A+0.0021)

V1：加入反應體(ti) 係中樣本體(ti) 積，0.25mL；V2：加入提取液體(ti) 積，1 mL；V3：加入血清（漿）體(ti) 積，0.1 mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500萬(wan) 。

注意：*低檢測限為(wei) 1μg/mL或1μg /g鮮重 或0.01μg /mg prot

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