脂肪酸合成酶（FAS）測試盒

脂肪酸合成酶（FAS）測試盒

微量法 100T/96S

注意：正式測定之前選擇2-3個(ge) 預期差異大的樣本做預測定。

測定意義(yi) ：

FAS是脂肪酸合成關(guan) 鍵酶，催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A而生成長鏈脂肪酸。FAS普遍表達於(yu) 各種組織細胞中，在哺乳動物肝、腎、腦、肺和乳腺以及脂肪組織中表達豐(feng) 富。

測定原理：

FAS催化乙酰CoA、丙二酰CoA和NADPH生成長鏈脂肪酸和NADP+；NADPH在340nm有吸收峰，而NADP+沒有；通過測定340nm 光吸收下降速率，計算FAS活性。

自備儀(yi) 器和用品：

研缽、冰、台式離心機、紫外分光光度計/酶標儀(yi) 、微量石英比色皿/96孔板、可調式移液槍和蒸餾水。

試劑組成和配製：

試劑一：液體(ti) 100mL×1瓶，－20℃保存。用前1d取出置於(yu) 4℃充分解凍後混勻。

試劑二：粉劑×1瓶。臨(lin) 用前加入440μL試劑四，充分溶解，用不完的試劑分裝後-20℃保存，禁止反複凍融。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。臨(lin) 用前加入440μL試劑四，充分溶解，用不完的試劑分裝後-20℃保存，禁止反複凍融。

試劑四：液體(ti) 20mL×1瓶, 4℃保存。

試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存。臨(lin) 用前加入840μL試劑四，充分溶解，用不完的試劑分裝後-20℃保存，禁止反複凍融。

粗酶液提取：

1. 組織：按照組織質量（g）：試劑一體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。12000g，4℃離心40min，取上清置冰上待測。

2. 細菌、真菌：按照細胞數量（104個(ge) ）：試劑一體(ti) 積（mL）為(wei) 500~1000：1的比例（建議500萬(wan) 細胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然後12000g，4℃，離心40min，取上清置於(yu) 冰上待測。

3. 血清等液體(ti) ：直接測定。

FAS測定操作：

1. 分光光度計/酶標儀(yi) 預熱30min，調節波長到340 nm，蒸餾水調零。

2. 試劑四置於(yu) 40℃水浴中預熱30 min。

3. 在96孔板或EP管中依次加入20μL上清液、4μL試劑二、4μL試劑三、164μL試劑四和8μL試劑五，混勻後於(yu) 340nm處測定吸光值，記錄第30s和90s時吸光值，分別記錄為(wei) A1和A2。△A測=A1-A2。

FAS活性計算：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按照蛋白濃度計算

活性單位定義(yi) ：37℃中每毫克蛋白每分鍾氧化1nmol NADPH 為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

FAS(nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V反總×109) ÷(Cpr×V樣)÷T

=1608×△A÷Cpr

（2）按照樣本質量計算

活性單位定義(yi) ：37℃中每克組織每分鍾氧化1nmol NADPH 為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

FAS(nmol/min/g 鮮重) = (△A÷ε÷d×V反總×109) ÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=1608×△A ÷W

（3）按細胞數量計算

活性單位定義(yi) ：37℃中每104個(ge) 細胞每分鍾氧化1nmol NADPH 為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

FAS(nmol /min/104cell) = (△A÷ε÷d×V反總×109) ÷(細胞數量×V樣÷V樣總)÷T

=1608×△A ÷細胞數量

（4）按液體(ti) 體(ti) 積計算

活性單位定義(yi) ：37℃中每毫升樣本每分鍾氧化1nmol NADPH 為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

FAS(nmol /min/mL) =(△A÷ε÷d×V反總×109) ÷V樣÷T

=1608×△A

ε：NADPH摩爾消光係數，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光徑，1 cm；V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，200μL=2×10-4L；Cpr：上清液蛋白質濃度，mg/mL；W ：樣品質量；V樣：加入反應體(ti) 係中上清液體(ti) 積，20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體(ti) 積，1 mL；T：反應時間，1min。

b.使用96孔板測定的計算公式如下

（1）按照蛋白濃度計算

活性單位定義(yi) ：37℃中每毫克蛋白每分鍾氧化1nmol NADPH 為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

FAS(nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V反總×109)÷(Cpr×V樣)÷T

=3216×△A÷Cpr

（2）按照樣本質量計算

活性單位定義(yi) ：37℃中每克組織每分鍾氧化1nmol NADPH 為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

FAS(nmol/min/g 鮮重) = (△A÷ε÷d×V反總×109) ÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=3216×△A÷W

（3）按細胞數量計算

活性單位定義(yi) ：37℃中每104個(ge) 細胞每分鍾氧化1nmol NADPH 為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

FAS(nmol /min/104cell) = (△A÷ε÷d×V反總×109)÷(細胞數量×V樣÷V樣總)÷T

=3216×△A÷細胞數量

（4）按液體(ti) 體(ti) 積計算

活性單位定義(yi) ：37℃中每毫升樣本每分鍾氧化1nmol NADPH 為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

FAS(nmol /min/mL) =(△A÷ε÷d×V反總×109 )÷V樣÷T

=3216×△A

ε：NADPH摩爾消光係數，6.22×103L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5 cm；V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，200μL=2×10-4L；Cpr：上清液蛋白質濃度，mg/mL；W ：樣品質量；V樣：加入反應體(ti) 係中上清液體(ti) 積，20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體(ti) 積，1 mL；T：反應時間，1min。

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