肉毒堿棕櫚酰轉移酶（CPT1)測試盒

肉毒堿棕櫚酰轉移酶（CPT1)測試盒

微量法 100管/96樣

正式測定前務必取2-3個(ge) 預期差異較大的樣本做預測定

測定意義(yi) ：

肉毒堿棕櫚酰轉移酶是存在於(yu) 線粒體(ti) 內(nei) 膜的一類酰基轉移酶。可逆地催化從(cong) 酰基輔酶A將酰基轉移至L-肉毒堿的反應，在轉運脂肪酸通過線粒體(ti) 內(nei) 膜的過程中起重要作用。                         

測定原理：

基於(yu) 肉堿和脂酰輔酶A在丙二酰輔酶A存在與(yu) 否的條件下，通過肉堿脂酰轉移酶(CPT-I)的作用，產(chan) 生脂酰肉堿，並釋放出巰基輔酶A(COA-SH)，與(yu) Ellman試劑DN-TB反應後，產(chan) 生黃色的TNB。通過其吸收峰值得變化（412nm），來定量分析CPT-1的活性。

需自備的儀(yi) 器和用品：

可見分光光度計/酶標儀(yi) 、台式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰、無水乙醇和蒸餾水

試劑組成和配製：

試劑一：液體(ti) 100mL×1瓶，-20℃保存；

試劑二：液體(ti) 20mL×1瓶，-20℃保存；

試劑三：液體(ti) 1.5mL×1支，-20℃保存；

試劑四：液體(ti) 30mL×1瓶，4℃保存；

試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存；

試劑六：粉劑×1支，-20℃保存；

樣本的前處理：

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與(yu) 線粒體(ti) 蛋白的分離：

• 稱取約0.1g組織或收集500萬(wan) 細胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

• 將勻漿液於(yu) 600g，4℃離心5min。

• 棄沉澱，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。

• 上清液即胞漿提取物，可用於(yu) 測定從(cong) 線粒體(ti) 泄漏的CPT-1（此步可選做）。

• 在步驟④的沉澱中加入200uL試劑二和2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3秒，間隔10秒，重複30次），用於(yu) 線粒體(ti) CPT-1測定。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標儀(yi) 預熱30min以上，調節波長至412nm，蒸餾水調零。

2、樣本測定

（1）在試劑五中加入1mL無水乙醇，混勻，再加入22mL試劑四，混勻，37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）孵育5min；用不完的試劑分裝後-20℃保存，禁止反複凍融；

（2）在試劑六中加入1mL蒸餾水，混勻，37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）孵育5min；用不完的試劑分裝後-20℃保存，禁止反複凍融；

（3）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、220μL試劑五和10μL試劑六，混勻，記錄412nm處20秒時的初始吸光度A1和2分20秒時的吸光度A2，計算ΔA=A2-A1。

CPT-1活性計算：

1. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下：

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義(yi) ：每mg組織蛋白每分鍾催化產(chan) 生1 nmol TNB定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

CPT-1（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=880×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義(yi) ：每g組織每分鍾催化產(chan) 生1 nmol TNB定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

CPT-1（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（W× V樣÷V樣總）÷T=177.8×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義(yi) ：每1萬(wan) 個(ge) 細菌或細胞每分鍾催化產(chan) 生1 nmol TNB定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

CPT-1（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=0.3556×ΔA

V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，2.4×10-4 L；ε：TNB摩爾消光係數，1.36×104 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體(ti) 積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，0.202 mL；T：反應時間，2 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細胞或細菌總數，500萬(wan) 。

2. 使用96孔板測定的計算公式如下：

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義(yi) ：每mg組織蛋白每分鍾催化產(chan) 生1 nmol TNB定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

CPT-1（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1760×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義(yi) ：每g組織每分鍾催化產(chan) 生1 nmol TNB定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

CPT-1（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（W ×V樣÷V樣總）÷T=355.6×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義(yi) ：每1萬(wan) 個(ge) 細菌或細胞每分鍾催化產(chan) 生1 nmol TNB定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

CPT-1（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=0.711×ΔA

V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，2.4×10-4 L；ε：TNB摩爾消光係數，1.36×104 L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體(ti) 積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，0.202 mL；T：反應時間，2 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細胞或細菌總數，500萬(wan) 。

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