羧酸酯酶（CarE）測試盒

羧酸酯酶（CarE）測試盒

 微量法 100T/96S

注意：正式測定之前選擇2-3個(ge) 預期差異大的樣本做預測定。

測定意義(yi) ：

哺乳動物CarE，也稱脂族酯酶（aliesterase），廣泛分布於(yu) 組織和器官，屬於(yu) 絲(si) 氨酸水解酶家族。CarE催化含酯鍵、酰胺鍵和硫酯鍵的內(nei) 源性與(yu) 外源性物質水解，但不能催化水解乙酰膽堿及其類似物。CarE參與(yu) 脂質運輸和代謝，並且與(yu) 多種藥物、環境毒物以及致癌物的解毒和代謝有關(guan) ，有機磷農(nong) 藥可結合並且抑製CarE活性。

測定原理：

CarE能催化乙酸-1-萘酯生成萘酯，固籃顯色；在450 nm光吸收增加速率，計算CarE活性。

自備儀(yi) 器和用品：

可見分光光度計/酶標儀(yi) 、微量玻璃比色皿/96孔板、低溫離心機、水浴鍋、可調式移液槍和蒸餾水。

試劑組成和配置：

試劑一：液體(ti) ×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體(ti) 15mL×2瓶， 4℃保存；

試劑三：粉劑×2支， 4℃保存，臨(lin) 用前取1支試劑三，加0.6ml無水乙醇充分溶解；

試劑四：粉劑×2支，-20℃保存，臨(lin) 用前取1支試劑四，加少量試劑二溶解；

工作液配製：臨(lin) 用前配製，向1瓶試劑二中，加入溶解後的試劑三和試劑四各1支，充分溶解，過濾，4℃避光保存，可用1周。

粗酶液提取：

細菌、細胞樣品製備

收集細菌或細胞到離心管內(nei) ，離心後棄上清；按照每200萬(wan) 細菌或細胞加入400μL試劑一，超聲波破碎細菌或細胞（功率20％，超聲3s，間隔10s，重複30次）；12000g 4℃離心30min，取上清液待測。

2、組織：按照組織質量（g）：試劑一體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿；12000g 4℃離心30min，取上清液待測。

3、液體(ti) ：直接測定

測定操作：

1. 分光光度計/酶標儀(yi) 預熱30min，調節波長到450 nm，蒸餾水調零。

2. 試劑二置於(yu) 37℃水浴中預熱30 min。

3. 空白管：取微量玻璃比色皿/96孔板，依次加入5μL蒸餾水和200μL試劑二，迅速混勻，於(yu) 450nm處測定3min內(nei) 吸光值變化，第10s吸光值記為(wei) A1，第190s吸光值記為(wei) A2。△A空白管=A2-A1

4. 測定管：取微量玻璃比色皿/96孔板，依次加入5μL上清液和200μL試劑二，迅速混勻，於(yu) 450nm處測定3min內(nei) 吸光值變化，第10s吸光值記為(wei) A3，第190s吸光值記為(wei) A4。△A測定管=A4-A3

注意：空白管隻需測定一次。

CarE活性計算公式：

1. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1 組織中CarE活性

1. 按蛋白濃度計算

CarE活性單位定義(yi) ：每mg組織蛋白在37℃反應體(ti) 係中每分鍾催化吸光值增加1定義(yi) 為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

CarE酶活(U/mg prot)= (△A測定管-△A空白管) ×V反總÷(Cpr×V樣)÷T

= 13.67×(△A測定管-△A空白管)÷Cpr

2. 按樣本鮮重計算

CarE活性單位定義(yi) ：每g組織在37℃反應體(ti) 係中每分鍾催化吸光值增加1定義(yi) 為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

CarE酶活(U/g 鮮重)= (△A測定管-△A空白管) ×V反總×（V樣總÷V樣）÷W÷T

=13.67×(△A測定管-△A空白管)÷W

2 細菌或細胞中CarE活性

CarE活性單位定義(yi) ：每1萬(wan) 個(ge) 細菌或細胞在37℃反應體(ti) 係中每分鍾催化吸光值增加1定義(yi) 為(wei) 一個(ge) CarE活性單位。

CarE酶活(U/104 cell)= (△A測定管-△A空白管) ×V反總×（V樣總÷V樣）÷細胞密度（104 cell/mL）÷T=13.67×(△A測定管-△A空白管)÷細胞密度（104 cell/mL）

3. 液體(ti) 中CarE活性

CarE活性單位定義(yi) ：每毫升樣品在37℃反應體(ti) 係中每分鍾催化吸光值增加1定義(yi) 為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

CarE酶活(U/mL )= (△A測定管-△A空白管) ×V反總÷V樣÷T

=13.67×(△A測定管-△A空白管)

V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，205μL=2.05×10-4L；V樣總：上清液總體(ti) 積，1 mL；V樣：加入上清液體(ti) 積(mL)，0.005 mL；Cpr：蛋白質濃度，mg/mL；W：樣品質量（g）；T：反應時間（min），3min。

2. 使用96孔板測定的計算公式如下

1 組織中CarE活性

3. 按蛋白濃度計算

CarE活性單位定義(yi) ：每mg組織蛋白在37℃反應體(ti) 係中每分鍾催化吸光值增加1定義(yi) 為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

CarE酶活(U/mg prot)= (△A測定管-△A空白管) ×V反總÷(Cpr×V樣)÷T

= 13.67×(△A測定管-△A空白管)÷Cpr

4. 按樣本鮮重計算

CarE活性單位定義(yi) ：每g組織在37℃反應體(ti) 係中每分鍾催化吸光值增加1定義(yi) 為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

CarE酶活(U/g 鮮重)= (△A測定管-△A空白管) ×V反總×（V樣總÷V樣）÷W÷T

=13.67×(△A測定管-△A空白管)÷W

2 細菌或細胞中CarE活性

CarE活性單位定義(yi) ：每1萬(wan) 個(ge) 細菌或細胞在37℃反應體(ti) 係中每分鍾催化吸光值增加1定義(yi) 為(wei) 一個(ge) CarE活性單位。

CarE酶活(U/104 cell)= (△A測定管-△A空白管) ×V反總×（V樣總÷V樣）÷細胞密度（104 cell/mL）÷T=13.67×(△A測定管-△A空白管)÷細胞密度（104 cell/mL）

3. 液體(ti) 中CarE活性

CarE活性單位定義(yi) ：每毫升樣品在37℃反應體(ti) 係中每分鍾催化吸光值增加1定義(yi) 為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

CarE酶活(U/mL )= (△A測定管-△A空白管) ×V反總÷V樣÷T

=13.67×(△A測定管-△A空白管)

V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，205μL=2.05×10-4L；V樣總：上清液總體(ti) 積，1 mL；V樣：加入上清液體(ti) 積(mL)，0.005 mL；Cpr：蛋白質濃度，mg/mL；W：樣品質量（g）；T：反應時間（min），3min。

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