吲哚乙酸氧化酶測試盒

吲哚乙酸氧化酶測試盒

微量法 100T/96S

注意：正式測定之前選擇2-3個(ge) 預期差異大的樣本做預測定。

測定意義(yi) ：

吲哚乙酸（IAA）在吲哚乙酸氧化酶的作用下，被氧化破壞失去活性。植物體(ti) 內(nei) 吲哚乙酸氧化酶活力的大小，對調節體(ti) 內(nei) 吲哚乙酸的水平，起著重要的作用，而影響植物的生長。

測定原理：
在無機酸存在情況下，吲哚乙酸能與(yu) FeCl3作用，生成紅色螯合物，該物質在530nm處有最大吸收峰，酶活力的大小可以其破壞吲哚乙酸的速度表示之。吲哚乙酸的含量可用比色法測定。

自備儀(yi) 器和用品：

低溫離心機、水浴鍋、可調節移液器、可見分光光度計/酶標儀(yi) 、1.5mL離心管、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸餾水。

試劑組成和配製：

試劑一：液體(ti) 120mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體(ti) 10mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：液體(ti) 10mL×1瓶，4℃保存。

試劑四：液體(ti) 10mL×1瓶，4℃保存。

試劑五：液體(ti) 2mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑六：液體(ti) 50mL×1瓶，4℃保存。臨(lin) 用前吸取1mL試劑五加入試劑六中混勻，待用，避光保存

粗酶液提取：

1. 組織：按照組織質量（g）：試劑一體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。

2. 細菌、真菌：按照細胞數量（104個(ge) ）：試劑一體(ti) 積（mL）為(wei) 500~1000：1的比例（建議500萬(wan) 細胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然後8000g，4℃，離心10min，取上清置於(yu) 冰上待測。

3. 血清等液體(ti) ：直接測定。

測定操作：

1. 分光光度計/酶標儀(yi) 預熱30min，調節波長到530 nm，蒸餾水調零。

2. 試劑二、試劑三、試劑四置於(yu) 25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動物）水浴中保溫20min。

3. 取1.5mL EP管若幹，按操作依次加入試劑，操作表如下：

注意：標準管隻需做一次

IAA氧化酶活性計算公式：

1. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

IAA標準曲線公式：y = 1.334x + 0.025  R2 = 0.998 （x為(wei) IAA濃度，mmol /L；y為(wei) 吸光值）

1. 按蛋白濃度計算

酶活定義(yi) ：從(cong) 開始時加入的IAA量減去酶作用後殘留的IAA含量，即得被酶所催化的IAA含量。以每mg酶蛋白在1h內(nei) 分解破壞的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

 U（μmol/h/mg prot）=[(A1-0.025) ÷1.334-(A2-0.025) ÷1.334] ×V樣÷（V樣×Cpr）÷T

=1.5×（A1-A2）÷Cpr

2. 按樣本鮮重計算

酶活定義(yi) ：以每g樣本在1h內(nei) 分解破壞的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

U（μmol/h/g 鮮重）=[(A1-0.025) ÷1.334-(A2-0.025) ÷1.334] ×V樣÷(V樣÷V樣總×W) ÷T

=1.5×（A1-A2）÷W

3. 按細胞數量計算

酶活定義(yi) ：以每1萬(wan) 個(ge) 細胞在1h內(nei) 分解破壞的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

U（μmol/h/104 cell）=[(A1-0.025) ÷1.334-(A2-0.025) ÷1.334] ×V樣÷(V樣÷V樣總×W) ÷T

=1.5×（A1-A2）÷細胞數量

4. 按液體(ti) 體(ti) 積計算

酶活定義(yi) ：以每mL酶液在1h內(nei) 分解破壞的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

U（μmol/h/mL）=[(A1-0.025) ÷1.334-(A2-0.025) ÷1.334] ×V樣÷(V樣÷V樣總) ÷T

=1.5×（A1-A2）

V樣總：上清液總體(ti) 積，1mL；V樣：加入反應體(ti) 係中上清液體(ti) 積，20μL=0.02 mL；Cpr：上清液蛋白質濃度，mg/mL；W：樣品質量，g，T：反應時間，0.5h。

b.使用96孔板測定的計算公式如下

IAA標準曲線公式：y = 0.667x + 0.025  R2 = 0.998 （x為(wei) IAA濃度，mmol /L；y為(wei) 吸光值）

（1）按蛋白濃度計算

酶活定義(yi) ：從(cong) 開始時加入的IAA量減去酶作用後殘留的IAA含量，即得被酶所催化的IAA含量。以每mg酶蛋白在1h內(nei) 分解破壞的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

 U（μmol/h/mg prot）=[(A1-0.025) ÷0.667-(A2-0.025) ÷0.667] ×V樣÷（V樣×Cpr）÷T

=3×（A1-A2）÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

酶活定義(yi) ：以每g樣本在1h內(nei) 分解破壞的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

U（μmol/h/g 鮮重）=[(A1-0.025) ÷0.667-(A2-0.025) ÷0.667] ×V樣÷(V樣÷V樣總×W) ÷T

=3×（A1-A2）÷W

（3）按細胞數量計算

酶活定義(yi) ：以每1萬(wan) 個(ge) 細胞在1h內(nei) 分解破壞的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

U（μmol/h/104 cell）=[(A1-0.025) ÷0.667-(A2-0.025) ÷0.667] ×V樣÷(V樣÷V樣總×W) ÷T

=3×（A1-A2）÷細胞數量

（4）按液體(ti) 體(ti) 積計算

酶活定義(yi) ：以每mL酶液在1h內(nei) 分解破壞的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

U（μmol/h/mL）=[(A1-0.025) ÷0.667-(A2-0.025) ÷0.667] ×V樣÷(V樣÷V樣總) ÷T

=3×（A1-A2）

V樣總：上清液總體(ti) 積，1mL；V樣：加入反應體(ti) 係中上清液體(ti) 積，20μL=0.02 mL；Cpr：上清液蛋白質濃度，mg/mL；W：樣品質量，g，T：反應時間，0.5h。

注意事項：

1. *低檢出限為(wei) 0.01μmol/mL。

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