中性轉化酶（NI）測試盒

中性轉化酶（NI）測試盒

正式測定前務必取2-3個(ge) 預期差異較大的樣本做預測定

測定意義(yi) ：

蔗糖轉化酶（Invertase，Ivr）催化蔗糖不可逆地分解為(wei) 果糖和葡萄糖，是高等植物蔗糖代謝關(guan) 鍵酶之一。根據最適 pH，將高等植物Ivr分為(wei) 酸性轉化酶（AI）和中性轉化酶（NI）兩(liang) 種類型。                           

NI主要存在於(yu) 細胞質中，負責分解細胞質中蔗糖為(wei) 果糖和葡萄糖。

測定原理：

NI催化蔗糖分解產(chan) 生還原糖，進一步與(yu) 3,5－二硝基水楊酸反應，生成棕紅色氨基化合物，在510nm有特征光吸收，在一定範圍內(nei) 510nm光吸收值與(yu) 還原糖生成量成正比。通過光吸收增加速率來計算NI活性

自備用品：

可見分光光度計/酶標儀(yi) 、台式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配製：

提取液：液體(ti) 100mL×1瓶，4℃保存;

試劑一：液體(ti) 20mL×1瓶，4℃保存;

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存；臨(lin) 用前加入10mL試劑一充分溶解備用；用不完的試劑4℃保存；

試劑三：液體(ti) 15mL×1瓶，4℃保存；

粗酶液提取：

按照組織質量（g）：提取液體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。12000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟和加樣表：

1. 分光光度計或酶標儀(yi) 預熱30min以上，調節波長至510nm，蒸餾水調零。

2、樣本測定，（在EP管中依次加入下列試劑）：

混勻， 37℃準確水浴30min後，95℃水浴10min（蓋緊，以防止水分散失），流水冷卻後充分混勻（以保證濃度不變）

混勻，95℃水浴10min（蓋緊，以防止水分散失），流水冷卻後充分混勻，取200μL至微量石英比色皿或96孔板中， 510nm處記錄各管吸光值A，如果吸光值大於(yu) 2，可以用蒸餾水稀釋後測定（計算公式中乘以相應稀釋倍數），ΔA=A測定-A對照。每個(ge) 測定管需設一個(ge) 對照管。

NI活性計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標準條件下測定的回歸方程為(wei) y = 0.0016x -0.001；x為(wei) 標準品濃度（μg/mL），y為(wei) 吸光值。

（1）按蛋白濃度計算：

單位的定義(yi) ：37℃每mg蛋白每分鍾產(chan) 生1μg還原糖定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活性單位。

NI活性（μg/min /mg prot）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(V1×Cpr ) ÷T=20.8×(ΔA +0.001) ÷Cpr

（2）按鮮重計算：

單位的定義(yi) ：37℃每g組織每分鍾產(chan) 生1μg還原糖定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活性單位。

NI活性（μg/min /g 鮮重）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(W×V1÷V2) ÷T=20.8×(ΔA +0.001) ÷W 

V1：加入反應體(ti) 係中樣本體(ti) 積，0.05mL；V2：加入提取液體(ti) 積，1mL；T：反應時間，30min； Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g。

b.用96孔板測定的計算公式如下

標準條件下測定的回歸方程為(wei) y = 0.0008x -0.001；x為(wei) 標準品濃度（μg/mL），y為(wei) 吸光值。

（1）按蛋白濃度計算：

單位的定義(yi) ：37℃每mg蛋白每分鍾產(chan) 生1μg還原糖定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活性單位。

NI活性（μg/min /mg prot）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0008×V1]÷(V1×Cpr ) ÷T=41.6×(ΔA +0.001) ÷Cpr

（2）按鮮重計算：

單位的定義(yi) ：37℃每g組織每分鍾產(chan) 生1μg還原糖定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活性單位。

NI活性（μg/min /g 鮮重）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0008×V1]÷(W ×V1÷V2) ÷T =41.6×(ΔA +0.001) ÷W 

V1：加入反應體(ti) 係中樣本體(ti) 積，0.05mL；V2：加入提取液體(ti) 積，1mL；T：反應時間，30min； Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g。

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