β木糖苷酶測試盒

β木糖苷酶測試盒

注意：正式測定之前選擇2-3個(ge) 預期差異大的樣本做預測定。

測定意義(yi) ：

β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)存在於(yu) 植物、細菌和真菌等生物體(ti) ，是催化木聚糖類半纖維素降解的關(guan) 鍵酶，產(chan) 物木糖可作為(wei) 碳源應用於(yu) 微生物發酵。另外，β-木糖苷酶還可以作為(wei) 生物漂白劑應用於(yu) 造紙工業(ye) ，比傳(chuan) 統的漂白法環保，具有廣泛的應用價(jia) 值。

測定原理：

β-木糖苷酶催化對硝基苯酚-β-D-木糖苷產(chan) 生對硝基苯酚，對硝基苯酚在405nm處有特征吸收峰，測定405nm光吸收增加速率，可計算β-木糖苷酶活性。

自備實驗用品及儀(yi) 器：

天平、低溫離心機、可見分光光度計/酶標儀(yi) 、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。

試劑組成和配製：

提取液：液體(ti) 100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體(ti) 1mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑二：液體(ti) 10mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：液體(ti) 10mL×1瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

組織：按照組織質量（g）：提取液體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進行冰浴勻漿，然後10000g，4℃，離心20min，取上清待測。

細菌、真菌：按照細胞數量（104個(ge) ）：提取液體(ti) 積（mL）為(wei) 500~1000：1的比例（建議500萬(wan) 細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然後10000g，4℃，離心10min，取上清置於(yu) 冰上待測。

液體(ti) ：直接檢測。

測定操作表：

1. 分光光度計/酶標儀(yi) 預熱30min，調節波長至405nm。

2. 操作表

β-木糖苷酶活性計算公式：

1. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標準曲線：y=13.226x+0.0011，R2=0.9998；x為(wei) 標準品濃度（μmol/mL），y為(wei) 吸光值ΔA。

1、按蛋白濃度計算

酶活定義(yi) ：45℃，pH7.4時每毫克蛋白1min內(nei) 催化產(chan) 生1 nmol對硝基苯酚為(wei) 一個(ge) 酶活單位。

β-木糖苷酶活性（nmol/min/ mg prot）=(ΔA-0.0011) ÷13.226×V反總÷（V樣×Cpr）÷T×1000

= 11.34×(ΔA -0.0011)÷ Cpr

2、按樣本質量計算：

酶活定義(yi) ：45℃，pH7.4時每克樣品1min內(nei) 催化產(chan) 生1 nmol對硝基苯酚為(wei) 一個(ge) 酶活單位。

β-木糖苷酶活性（nmol/min/g 鮮重）=(ΔA-0.0011) ÷13.226×V反總÷（V樣÷V樣總×W）÷T×1000= 11.34×(ΔA-0.0011)÷W

3. 按細胞數量計算：

酶活定義(yi) ：45℃，pH7.4時每104個(ge) 細胞1min內(nei) 催化產(chan) 生1 nmol對硝基苯酚為(wei) 一個(ge) 酶活單位。

β-木糖苷酶活性（nmol/min/104cell）=(ΔA-0.0011) ÷13.226×V反總÷V樣×V樣總÷細胞數量（萬(wan) 個(ge) ）÷T×1000=11.34×(ΔA-0.0011) ÷ 細胞數量（萬(wan) 個(ge) ）

（4）按液體(ti) 體(ti) 積計算

酶活定義(yi) ：45℃，pH7.4時每毫升液體(ti) 1min內(nei) 催化產(chan) 生1 nmol對硝基苯酚為(wei) 一個(ge) 酶活單位。

β-木糖苷酶活性（nmol/min/ mL）=(ΔA-0.0011) ÷13.226×V反總÷V樣÷T×1000

=11.34×(ΔA-0.0011)

V樣總：加入提取液體(ti) 積，1mL； V反總：反應總體(ti) 積，0.12mL；V樣：反應中樣品體(ti) 積，0.04mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣品質量，g；T：反應時間，20min；1000:1μmol/L=1000nmol/L

b.用96孔板測定的計算公式如下

標準曲線：y=6.613x+0.0011，R2=0.9998；x為(wei) 標準品濃度（μmol/mL），y為(wei) 吸光值ΔA

1、按蛋白濃度計算

酶活定義(yi) ：45℃，pH7.4時每毫克蛋白1min內(nei) 催化產(chan) 生1 nmol對硝基苯酚為(wei) 一個(ge) 酶活單位。

β-木糖苷酶活性（nmol/min/ mg prot）=(ΔA-0.0011) ÷6.613×V反總÷（V樣×Cpr）÷T×1000

= 22.68×(ΔA -0.0011)÷ Cpr

2、按樣本質量計算：

酶活定義(yi) ：45℃，pH7.4時每克樣品1min內(nei) 催化產(chan) 生1 nmol對硝基苯酚為(wei) 一個(ge) 酶活單位。

β-木糖苷酶活性（nmol/min/g 鮮重）=(ΔA-0.0011) ÷6.613×V反總÷（V樣÷V樣總×W）÷T×1000= 22.68×(ΔA-0.0011)÷W

3. 按細胞數量計算：

酶活定義(yi) ：45℃，pH7.4時每104個(ge) 細胞1min內(nei) 催化產(chan) 生1 nmol對硝基苯酚為(wei) 一個(ge) 酶活單位。

β-木糖苷酶活性（nmol/min/104cell）=(ΔA-0.0011) ÷6.613×V反總÷V樣×V樣總÷細胞數量（萬(wan) 個(ge) ）÷T×1000=22.68×(ΔA-0.0011) ÷ 細胞數量（萬(wan) 個(ge) ）

（4）按液體(ti) 體(ti) 積計算

酶活定義(yi) ：45℃，pH7.4時每毫升液體(ti) 1min內(nei) 催化產(chan) 生1 nmol對硝基苯酚為(wei) 一個(ge) 酶活單位。

β-木糖苷酶活性（nmol/min/ mL）=(ΔA-0.0011) ÷6.613×V反總÷V樣÷T×1000

=22.68×(ΔA-0.0011)

V樣總：加入提取液體(ti) 積，1mL； V反總：反應總體(ti) 積，0.12mL；V樣：反應中樣品體(ti) 積，0.04mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣品質量，g；T：反應時間，20min；1000:1μmol/mL=1000nmol/mL

ΔA控製在0.01-1範圍內(nei) ，若ΔA大於(yu) 1，可適當減小樣本量。

標準曲線線性範圍為(wei) ：0.01μmol/mL-0.5μmol/mL。

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