β澱粉酶測試盒

β澱粉酶測試盒

正式測定前務必取2-3個(ge) 預期差異較大的樣本做預測定

測定意義(yi) ：

澱粉酶負責水解澱粉，主要包括α-澱粉酶和β-澱粉酶。β-澱粉酶(EC 3.2.1.2)可隨機地作用於(yu) 澱粉中的α-1,4-糖苷鍵，生成葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖。

測定原理：

還原糖還原3,5-二硝基水楊酸生成棕紅色物質。α-澱粉酶不耐酸，β-澱粉酶不耐熱。根據上述特性，鈍化其中之一，就可測出另一種澱粉酶的活力。

需自備的儀(yi) 器和用品：

可見分光光度計/酶標儀(yi) 、恒溫水浴鍋、離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽和蒸餾水。

試劑的組成和配製：

試劑一：30mL×1瓶，常溫保存，若有黃色晶體(ti) 析出，需90℃加熱溶解後再用；

試劑二：15mL×1瓶，4℃保存，若出現沉澱析出，需70℃加熱溶解後再用。

粗酶液提取：

組織：稱取0.1~0.2g樣本（建議稱取約0.1g樣本），加入1mL蒸餾水，研磨勻漿；將勻漿倒入離心管中，提取液在室溫下放置提取15min，每5min振蕩1次，使其充分提取；3000g，25℃離心10min，取上清液加蒸餾水定容至10 mL，搖勻，即澱粉酶原液。

吸取上述澱粉酶原液1mL，加入4mL蒸餾水，搖勻，即為(wei) 澱粉酶稀釋液，用於(yu) （α＋β）澱粉酶總活力的測定。

血清（漿）等液體(ti) 樣本：（1）直接檢測α-澱粉酶。（2）吸取澱粉酶原液1mL，加入4mL蒸餾水，搖勻，即為(wei) 澱粉酶稀釋液，用於(yu) （α＋β）澱粉酶總活力的測定。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標儀(yi) 預熱30min以上，調節波長到540 nm，蒸餾水調零。

2、試劑一和試劑二40℃預熱10min.

3、測定操作表：

70℃水浴15min左右，冷卻

40℃恒溫水浴中準確保溫5min

混勻，95度水浴5min，冷卻，取200μL 至微量石英比色皿或96孔板中，540nm處讀取吸光值，從(cong) 左到右分別記為(wei) A1、A2、A3和A4。每個(ge) 測定管需設一個(ge) 對照管。

酶活性計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、標準條件下測定回歸曲線為(wei) y=3.7215x -0.1778； x為(wei) 標準品濃度（mg/mL），y為(wei) 吸光值。

2、α澱粉酶活性

（1）按照樣本質量計算

單位定義(yi) ：每g組織每分鍾催化產(chan) 生1mg還原糖定義(yi) 為(wei) 1個(ge) 酶活力單位。

α澱粉酶活性(mg/min/g鮮重)=[(A2-A1＋0.1778)÷3.7215×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=1.075×(A2-A1＋0.1778)÷W

（2）按照蛋白質含量計算

單位定義(yi) ：每mg組織蛋白每分鍾催化產(chan) 生1mg還原糖定義(yi) 為(wei) 1個(ge) 酶活性單位。

α澱粉酶活性(mg/min/mg prot)= [(A2-A1＋0.1778)÷3.7215×V反總]÷（V樣×Cpr）÷T

=0.1075×(A2-A1＋0.1778) ÷Cpr

（3）血清（漿）等液體(ti) 樣本中α澱粉酶活性計算

單位定義(yi) ：每mL血清（漿）每分鍾催化產(chan) 生1mg還原糖定義(yi) 為(wei) 1個(ge) 酶活性單位。

α澱粉酶活性(mg/min/mL)= [(A2-A1＋0.1778)÷3.7215×V反總]÷V樣÷T=0.1075×(A2-A1＋0.1778)

3、總澱粉酶活性計算

（1）按照樣品質量計算

單位定義(yi) ：每g組織每分鍾催化產(chan) 生1mg還原糖定義(yi) 為(wei) 1個(ge) 酶活力單位。

總澱粉酶活性(mg/min//g鮮重)=5×[(A4-A3＋0.1778)÷3.7215×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=5.375×(A4-A3＋0.1778)÷W

（2）按照蛋白質含量計算

單位定義(yi) ：每mg組織蛋白每分鍾催化產(chan) 生1mg還原糖定義(yi) 為(wei) 1個(ge) 酶活力單位。

總澱粉酶活性(mg/min/mg prot)=5×[(A4-A3＋0.1778)÷3.7215×V反總]÷（V樣×Cpr）÷T

=0.5375×(A4-A3＋0.1778) ÷Cpr

（3）血清（漿）等液體(ti) 樣本中總澱粉酶活性計算

單位定義(yi) ：每mL血清（漿）每分鍾催化產(chan) 生1mg還原糖定義(yi) 為(wei) 1個(ge) 酶活性單位。

總澱粉酶活性(mg/min/mL) =5×[(A4-A3＋0.1778)÷3.7215×V反總]÷V樣÷T

=0.5375×(A4-A3＋0.1778)

4、β-澱粉酶活性計算

（1）按照樣本質量計算

單位定義(yi) ：每g組織在反應體(ti) 係中每分鍾催化產(chan) 生1mg還原糖定義(yi) 為(wei) 1個(ge) 酶活力單位。

β-澱粉酶活性(mg/min/g鮮重)=澱粉酶總活性-α-澱粉酶活性=[5.375×(A4-A3＋0.1778)-1.075×(A2-A1＋0.1778)]÷W

（2）按照蛋白質含量計算

單位定義(yi) ：每mg組織蛋白每分鍾催化產(chan) 生1mg還原糖定義(yi) 為(wei) 1個(ge) 酶活力單位。

β-澱粉酶活性（mg/min/mg prot）=澱粉酶總活性-α-澱粉酶活性=[0.5375×(A4-A3＋0.1778)-0.1075×(A2-A1＋0.1778)]÷Cpr

（3）血清（漿）等液體(ti) 樣本中β-澱粉酶活性計算

單位定義(yi) ：每mL血清（漿）每分鍾催化產(chan) 生1mg還原糖定義(yi) 為(wei) 1個(ge) 酶活性單位。

β-澱粉酶活性（mg/min/mL）=澱粉酶總活性-α-澱粉酶活性=0.5375×(A4-A3＋0.1778)-0.1075×(A2-A1＋0.1778)

5：總澱粉酶稀釋倍數；V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，0.15mL；V樣：加入反應體(ti) 係中樣本體(ti) 積，0.075 mL；V樣總：提取液總體(ti) 積，10 mL； Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；T：反應時間，5min。

b.用96孔板測定的計算公式如下

1、標準條件下測定回歸曲線為(wei) y=2.481x -0.1778； x為(wei) 標準品濃度（mg/mL），y為(wei) 吸光值。

2、α澱粉酶活性

（1）按照樣本質量計算

單位定義(yi) ：每g組織每分鍾催化產(chan) 生1mg還原糖定義(yi) 為(wei) 1個(ge) 酶活力單位。

α澱粉酶活性(mg/min/g鮮重)=[(ΔA＋0.1778)÷2.481×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=1.612×(ΔA＋0.1778)÷W

（2）按照蛋白質含量計算

單位定義(yi) ：每mg組織蛋白每分鍾催化產(chan) 生1mg還原糖定義(yi) 為(wei) 1個(ge) 酶活性單位。

α澱粉酶活性（mg/min/mg prot）=[(ΔA＋0.1778)÷2.481×V反總]÷（V樣×Cpr）÷T =0.1612×(ΔA＋0.1778) ÷Cpr

（3）血清（漿）等液體(ti) 樣本中α澱粉酶活性計算

單位定義(yi) ：每mL血清（漿）每分鍾催化產(chan) 生1mg還原糖定義(yi) 為(wei) 1個(ge) 酶活性單位。

α澱粉酶活性（mg/min/mL）=[(ΔA＋0.1778)÷2.481×V反總]÷V樣÷T =0.1612×(ΔA＋0.1778)

3、總澱粉酶活性計算

（1）按照樣本質量計算

單位定義(yi) ：每g組織每分鍾催化產(chan) 生1mg還原糖定義(yi) 為(wei) 1個(ge) 酶活力單位。

總澱粉酶活性(mg/min/g鮮重)=5×[(A4-A3＋0.1778)÷2.481×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=8.06×(ΔA＋0.1778)÷W

（2）按照蛋白質含量計算

單位定義(yi) ：每mg組織蛋白每分鍾催化產(chan) 生1mg還原糖定義(yi) 為(wei) 1個(ge) 酶活力單位。

總澱粉酶活性(mg/min/mg prot)=5×[(A4-A3＋0.1778)÷2.481×V反總]÷（V樣×Cpr）÷T

=0.806×(A4-A3＋0.1778) ÷Cpr

（3）血清（漿）等液體(ti) 樣本中總澱粉酶活性計算

單位定義(yi) ：每mL血清（漿）每分鍾催化產(chan) 生1mg還原糖定義(yi) 為(wei) 1個(ge) 酶活性單位。

總澱粉酶活性(mg/min/mL)=5×[(A4-A3＋0.1778)÷2.481×V反總]÷V樣÷T

=0.806×(A4-A3＋0.1778)

4、β-澱粉酶活性計算

（1）按照樣本質量計算

單位定義(yi) ：每g組織在反應體(ti) 係中每分鍾催化產(chan) 生1mg還原糖定義(yi) 為(wei) 1個(ge) 酶活力單位。

β-澱粉酶活性(mg/min/g鮮重)=澱粉酶總活性-α-澱粉酶活性=[8.06×(A4-A3＋0.1778)-1.612×(A2-A1＋0.1778)]÷W

（2）按照蛋白質含量計算

單位定義(yi) ：每mg組織蛋白每分鍾催化產(chan) 生1mg還原糖定義(yi) 為(wei) 1個(ge) 酶活力單位。

β-澱粉酶活性（mg/min/mg prot）=澱粉酶總活性-α-澱粉酶活性=[0.806×(A4-A3＋0.1778)-0.1612×(A2-A1＋0.1778)]÷Cpr

（3）血清（漿）等液體(ti) 樣本中β-澱粉酶活性計算

單位定義(yi) ：每mL血清（漿）每分鍾催化產(chan) 生1mg還原糖定義(yi) 為(wei) 1個(ge) 酶活性單位。

β-澱粉酶活性（mg/min/mL）=澱粉酶總活性-α-澱粉酶活性=0.806×(A4-A3＋0.1778)-0.1612×(A2-A1＋0.1778)

5：總澱粉酶稀釋倍數；V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，0.15mL；V樣：加入反應體(ti) 係中樣本體(ti) 積，0.075 mL；V樣總：提取液總體(ti) 積，10 mL； Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；T：反應時間，5min。

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