N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶（N-acetyl-β-D-glucosidase, NAG）試劑盒

N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶（N-acetyl-β-D-glucosidase, NAG）試劑盒

正式測定前務必取2-3個(ge) 預期差異較大的樣本做預測定

測定意義(yi) ：

NAG是溶酶體(ti) 中的一種酸性水解酶，廣泛存在於(yu) 各種組織、體(ti) 液和細胞中，以前列腺和腎近曲小管細胞內(nei) 含量最高。NAG活性變化與(yu) 機體(ti) 某些病理狀態密切相關(guan) 。

測定原理：

NAG分解β-N-乙酰氨基葡萄糖苷生成對-硝基苯酚，後者在400nm有最大吸收峰，通過測定吸光值升高速率來計算NAG活性。

自備用品：

酶標儀(yi) /可見分光光度計、台式離心機、水浴鍋、可調式移液器、96孔板/微量石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配製：

提取液：液體(ti) 100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨(lin) 用前加入2.5mL蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑仍-20℃保存。

試劑二：液體(ti) 4mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：液體(ti) 13mL×1瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

1、細菌或培養(yang) 細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nei) ，離心後棄上清；按照細菌或細胞數量（104個(ge) ）：提取液體(ti) 積（mL）為(wei) 500~1000：1的比例（建議500萬(wan) 細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重複30次）；15000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質量（g）：提取液體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。15000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1. 酶標儀(yi) 或分光光度計預熱30min以上，調節波長至400nm，蒸餾水調零。

2、樣本測定（在EP管或96孔板中依次加入下列試劑）：

迅速混勻，放入37℃保溫30min

充分混勻， 400nm處測定吸光值A，計算ΔA=A測定-A對照。每個(ge) 測定管需設一個(ge) 對照管。

NAG活性計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、標準條件下測定的回歸方程為(wei) y = 0.00585x +0.0083；x為(wei) 標準品濃度（nmol/mL），y為(wei) 吸光值。

2、血清（漿）NAG活力的計算

單位的定義(yi) ：每mL血清（漿）每分鍾產(chan) 生1nmol對-硝基苯酚定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活性單位。

NAG活力(nmol /min/mL)= [(ΔA-0.0083) ÷0.00585×V反總]÷V樣÷T =39.89×(ΔA-0.0083)

3、細胞、細菌和組織中NAG活力的計算

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義(yi) ：每mg組織蛋白每分鍾產(chan) 生1nmol對-硝基苯酚定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活性單位。

NAG活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0083) ÷0.00585×V反總]÷(V樣×Cpr)÷T

=39.89×(ΔA-0.0083) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義(yi) ：每g組織每分鍾產(chan) 生1nmol對-硝基苯酚定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活性單位。

NAG活性(nmol/min/g鮮重)= [(ΔA-0.0083) ÷0.00585×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=39.89×(ΔA-0.0083)÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義(yi) ：每1萬(wan) 個(ge) 細菌或細胞每分鍾產(chan) 生1nmol對-硝基苯酚定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活性單位。

NAG活性(nmol/min /104cell) =[(ΔA-0.0083) ÷0.00585×V反總]÷(500×V樣÷V樣總)÷T

=0.08×(ΔA-0.0083)

V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，0.07mL；V樣：加入反應體(ti) 係中樣本體(ti) 積，0.01mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，1mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g； 500：細胞或細菌總數，500萬(wan) ；T：反應時間，30min。

b.用96孔板測定的計算公式如下

1、標準條件下測定的回歸方程為(wei) y = 0.0039x +0.0083；x為(wei) 標準品濃度（nmol/mL），y為(wei) 吸光值。

2、血清（漿）NAG活力的計算

單位的定義(yi) ：每mL血清（漿）每分鍾產(chan) 生1nmol對-硝基苯酚定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活性單位。

NAG活力(nmol /min/mL)= [(ΔA-0.0083) ÷0.0039×V反總]÷V樣÷T =59.83×(ΔA-0.0083)

3、細胞、細菌和組織中NAG活力的計算

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義(yi) ：每mg組織蛋白每分鍾產(chan) 生1nmol對-硝基苯酚定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活性單位。

NAG活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0083) ÷0.0039×V反總]÷(V樣×Cpr)÷T

=59.83×(ΔA-0.0083) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義(yi) ：每g組織每分鍾產(chan) 生1nmol對-硝基苯酚定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活性單位。

NAG活性(nmol/min/g鮮重)= [(ΔA-0.0083) ÷0.0039×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=59.83×(ΔA-0.0083)÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義(yi) ：每1萬(wan) 個(ge) 細菌或細胞每分鍾產(chan) 生1nmol對-硝基苯酚定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活性單位。

NAG活性(nmol/min /104cell) =[(ΔA-0.0083) ÷0.0039×V反總]÷(500×V樣÷V樣總)÷T

=0.12×(ΔA-0.0083)

V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，0.07mL；V樣：加入反應體(ti) 係中樣本體(ti) 積，0.01mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，1mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g； 500：細胞或細菌總數，500萬(wan) ；T：反應時間，30min。

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