VirusStars 慢病毒包裝細胞係，產(chan) 品編碼：CL110001。

VirusStars 慢病毒包裝細胞係，

ViralStarsTM  Lentivirus Packaging Cell Line

01/產(chan) 品概述

慢病毒是一種逆轉錄病毒，能使外源基因整合入宿主細胞的基因組，實現外源基因穩定、長期的表達，比一般的逆轉錄病毒具有更高的滴度和更廣的宿主範圍。攜帶外源基因的慢病毒載體(ti) 與(yu) 包裝載體(ti) （產(chan) 生病毒顆粒所需的輔助蛋白）一同轉染包裝細胞，即可進行病毒的包裝。包裝好的慢病毒為(wei) 假型病毒（病毒感染目的細胞後不會(hui) 再感染其他細胞，也不會(hui) 利用宿主細胞產(chan) 生新的病毒顆粒，慢病毒中的毒性基因已被剔除並被外源性目的基因所取代），分泌到細胞外的培養(yang) 基中，經過離心取得上清液後進行慢病毒濃縮，濃縮後的慢病毒液可以直接用於(yu) 宿主細胞的感染，目的基因進入到宿主細胞後，經過反轉錄，整合到基因組，從(cong) 而實現外源基因在宿主細胞中的表達（下圖）。

要充分利用慢病毒包裝係統產(chan) 生高滴度的慢病毒顆粒，就需要宿主細胞係具備易於(yu) 轉染並且可以高水平表達病毒蛋白質的特性。我們(men) 的ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line經過了克隆篩選，可以充分滿足這些需求。當與(yu) 我們(men) 優(you) 質的ViralStars LP Lentivirus Packaging Kit（LP110）高滴度慢病毒包裝試劑盒配合使用時，可以獲得更高的慢病毒滴度（高達108 TU/mL）。ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line是人胚胎腎細胞轉化細胞HEK 293的亞(ya) 克隆，經過基因編輯改進後篩選出的單克隆細胞株，具備高細胞活性、低細胞凋亡水平、可高度轉染並高水平表達病毒蛋白質等特性。

02/產(chan) 品組分

03/保存條件

為(wei) 確保細胞活力，細胞產(chan) 品接收後應立即進行細胞培養(yang) 及後續操作（詳見05/實驗步驟）。

04/產(chan) 品特點

² 高細胞活性、低細胞凋亡水平

² 高度易於(yu) 轉染

² 高水平表達重組慢病毒

05/實驗步驟

一、ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line細胞傳(chuan) 代

1. 待細胞密度達90% 左右，即可進行傳(chuan) 代培養(yang) 。棄去舊培養(yang) 基，用PBS潤洗細胞1-2次。

2. 加入適量胰酶消化液，置於(yu) 37℃培養(yang) 箱中消化細胞約1-2分鍾，顯微鏡下觀察細胞消化情況，若觀察到大部分細胞變圓並脫落，則迅速拿回操作台，加入與(yu) 胰酶等量的*培養(yang) 基（DMEM，10% FBS，1% 雙抗）終止消化。

3. 輕輕吹打細胞，使細胞*脫落後吸出，1000 rpm離心5分鍾，棄去上清液，用新鮮的*培養(yang) 基重懸細胞。

4. 將細胞懸液按合適的比例（推薦1:4-1:5）接種到新的培養(yang) 皿或培養(yang) 瓶中，置於(yu) 37℃ 5% CO2培養(yang) 箱中繼續培養(yang) 。

二、ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line細胞凍存

1. 選擇處於(yu) 指數生長期的細胞，按照常規方法收集細胞於(yu) 離心管中。

2. 1000 rpm，離心5分鍾，收集培養(yang) 細胞沉澱，棄上清液。

3. 加入適量4℃預冷的LeapWal Cell Freezing Medium (1x)(PZ110R) 重懸細胞，製成細胞懸液。

Ø 按照細胞密度和所用細胞凍存管的尺寸計算所需凍存液的量，推薦凍存密度：1x106 至5x106 cells/mL。

4. 將細胞懸液分裝至已標記的凍存管中，建議每管1mL或1.5mL。

5. 直接將細胞凍存管放入-80℃超低溫冰箱中，可長期冷凍保存。如果想放入液氮中長期保存，需先放入-80℃冰箱至少12小時，方可移至液氮罐中長期保存。

三、ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line細胞複蘇

1. 在15 mL離心管中加入5-10 mL平衡至室溫的*培養(yang) 基。

2. 從(cong) -80℃冰箱/液氮中取出凍存的細胞，立即放入37℃水浴鍋或其他細胞複蘇設備中，迅速解凍。

3. 將凍存管中的細胞懸液逐滴轉移至預先準備好的含*培養(yang) 基的離心管中，1000 rpm，離心5分鍾，收集細胞沉澱，棄上清（操作時小心，切勿將細胞沉澱移去）。

4. 加入適量平衡至室溫的*培養(yang) 基重懸細胞，接種到事先準備好的培養(yang) 容器中，輕輕搖晃培養(yang) 容器，使細胞分布均勻。

5. 培養(yang) 5-16 h後，觀察細胞狀態，可視情況更換預熱的新鮮*培養(yang) 液，之後進行常規細胞培養(yang) 及傳(chuan) 代。

06/適用範圍

ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line經過了基因編輯及單克隆篩選，具備高細胞活性、低細胞凋亡水平、可高度轉染並高水平表達病毒蛋白等特性，兼容所有慢病毒包裝體(ti) 係。

07/注意事項

1. 該產(chan) 品與(yu) 我們(men) 優(you) 質的ViralStars LP Lentivirus Packaging Kit（LP110）高滴度慢病毒包裝試劑盒配合使用時，可以獲得更高的慢病毒滴度（高達108 TU/mL）。

2. 為(wei) 了您的健康安全，請規範操作，穿戴實驗服與(yu) 手套開展實驗。

3. 所有慢病毒操作均需在BSL2級生物安全櫃中進行。

4. 本產(chan) 品僅(jin) 供科研使用，請勿用於(yu) 臨(lin) 床診斷及治療。

08/實驗案例分析

1. 提前一天使用10 cm細胞培養(yang) 皿培養(yang) ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line（CL110001）及其它兩(liang) 種常用HEK 293包裝細胞係（HEK293T、293FT），待細胞密度為(wei) 75% 左右開始包裝慢病毒。

2. 使用ViralStars LP Lentivirus Packaging Kit（LP110-10）進行慢病毒包裝。取3個(ge) 2 mL EP管，分別加入10 μL慢病毒包裝輔助質粒混合物（Package Plasmid Mix），2.5 μL表達GFP的對照質粒（Control Plasmid），輕輕混合，加入32 μL PolyShooter轉染試劑與(yu) 質粒混合，室溫孵育3分鍾。

3. 往上述混合物中加入1.8 mL無血清無雙抗的DMEM基礎培養(yang) 基，輕輕混勻，在室溫下靜置30分鍾，形成轉染試劑-核酸複合物。

4. 將上述1.8 mL轉染試劑-核酸複合物輕輕地逐滴均勻加入10 cm皿慢病毒包裝細胞中，輕輕搖動培養(yang) 皿混勻，做好標記，置於(yu) 37℃，5% CO2培養(yang) 箱中培養(yang) 產(chan) 毒。

5. 轉染24 h後，棄去初始病毒上清液，加入10 mL新鮮的*培養(yang) 基(DMEM +10% FBS)至10 cm細胞培養(yang) 皿中，置於(yu) 37℃，5% CO2培養(yang) 箱繼續培養(yang) 。

6. 轉染48 h後，收集病毒上清液，再加入10 mL新鮮的*培養(yang) 基(DMEM +10% FBS)至10 cm細胞培養(yang) 皿中，置於(yu) 37℃，5% CO2培養(yang) 箱繼續培養(yang) 。

7. 轉染72 h後，進行二次病毒上清液收集，與(yu) 48 h收集的上清液混合後，300xg離心10分鍾以除去細胞碎片，0.22 μm濾器過濾，使用ViralStars LC Lentivirus Concentration Solution慢病毒濃縮試劑盒（LC110R）進行20倍濃縮，使用1 mL ViralStars LS Lentivirus Storage Solution（LS110R）分別重懸三組慢病毒顆粒。

8. 孔稀釋法測定病毒滴度。

(1) Day1：準備細胞

對生長狀態良好的293T細胞消化計數後稀釋至
1-3x105個(ge) 
/mL
，加入96孔板，100
μL/孔（1-3x104個(ge) 
/孔），每⼀種慢病毒設6個(ge) 梯度孔，置於(yu) 37℃，5% CO2培養(yang) 箱中培養(yang) 。

(2) Day2：病毒的稀釋與(yu) 感染

在EP管中做10倍梯度稀釋，連續6個(ge) 稀釋梯度。稀釋方法如下：準備6個(ge) ⽆菌EP管，每個(ge) EP管中加⼊90μL 新鮮的*培養(yang) 基（含10 μg/mL polybrene），取待測定病毒液10 μL加⼊到第⼀個(ge) EP管中（標記10 μL），混勻後取10 μL病毒稀釋液加⼊到第⼆個(ge) EP管中（標記1 μL），以此類推，直到稀釋到最後⼀管。棄去96孔板中原有的培養(yang) 基，將稀釋好的病毒依次加入孔中，並做好標記，⼩⼼操作，不要吹起細胞，置於(yu) 培養(yang) 箱中培養(yang) 16 h。

(3) Day3：棄病毒，換液

吸去含病毒的培養(yang) 基，在每個(ge) 孔中再加入
100 μL
預熱的新鮮*培養(yang) 基。

(4) Day4：熒光計數與(yu) 滴度計算

感染36-48 h後，采用流式細胞術對熒光比例合適（10%-50%）的連續兩(liang) 個(ge) 梯度進行陽性細胞統計，計算出病毒滴度，實驗結果如圖2所示。

圖2: ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line慢病毒包裝細胞係可製備出更高滴度的慢病毒顆粒。

我們(men) 使用ViralStars LP Lentivirus Packaging Kit（LP110-10）進行慢病毒包裝，比較ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line和其它兩(liang) 種常用HEK 293包裝細胞係的病毒製備能力，ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line明顯優(you) 於(yu) 其他細胞係——所獲得的病毒滴度比293FT細胞高出10倍，比親(qin) 代HEK 293細胞係高出26倍。

09/其他相關(guan) 產(chan) 品

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