ViralStars 慢病毒包裝試劑盒，產(chan) 品編碼：LP110。

ViralStars 慢病毒包裝試劑盒

ViralStarsTM LP

Lentivirus Packaging Kit

Catalog Number：LP110

01/產(chan) 品概述

慢病毒是一種有包膜的RNA病毒，直徑為(wei) 80-120 nm，呈二十麵體(ti) 對稱結構、球形。病毒顆粒最外層是包膜（包膜蛋白決(jue) 定了感染細胞的類型），再往裏依次為(wei) 基質蛋白和衣殼，最裏麵是兩(liang) 條相同的正股RNA鏈和酶（逆轉錄酶、整合酶和蛋白酶）。

慢病毒表達載體(ti) 包含了包裝、轉染、穩定整合所需要的遺傳(chuan) 信息。慢病毒包裝質粒可提供包裝重組慢病毒載體(ti) 所需的所有輔助蛋白。為(wei) 產(chan) 生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達載體(ti) 和包裝質粒同時共轉染細胞，在細胞中進行病毒包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養(yang) 基中，離心取得上清液後，可以直接或濃縮後用於(yu) 宿主細胞的感染。

慢病毒感染細胞的第一步是通過包膜蛋白與(yu) 細胞表麵受體(ti) 結合。慢病毒與(yu) 宿主細胞膜融合後釋放結構蛋白、酶蛋白和病毒核心。病毒RNA在逆轉錄酶的作用下逆轉錄並與(yu) 整合酶形成整合前複合物。整合前複合物進入細胞核後，整合酶催化其整合至宿主基因組。整合後的DNA轉錄為(wei) mRNA，回到細胞漿中，表達目的蛋白或產(chan) 生RNAi幹擾。

ViralStars LP Lentivirus Packaging Kit慢病毒包裝試劑盒屬於(yu) 第二代慢病毒包裝體(ti) 係，同時可兼容第二代和第三代慢病毒包裝質粒。慢病毒中的毒性基因已經被剔除並被外源性目的基因所取代，屬於(yu) 假型病毒，即產(chan) 生的慢病毒感染目的細胞後不會(hui) 再感染其他細胞，也不會(hui) 利用宿主細胞產(chan) 生新的病毒顆粒。ViralStars LP Lentivirus Packaging Kit包裝的慢病毒具有感染效率高、感染譜廣等特點，可實現外源基因在宿主細胞中的穩定持續表達。經該試劑盒包裝獲得的對照質粒病毒滴度可達108 TU/mL。

ViralStars LP Lentivirus Packaging Kit慢病毒包裝試劑盒包含如下組分：

(1) 優(you) 化配比的慢病毒包裝輔助質粒混合物（Package Plasmid Mix），經過設計調整，可兼容大多數慢病毒表達載體(ti) ，確保將重組子包裝成具有高感染率的慢病毒顆粒。

(2) 表達GFP 和 Puro標記的對照質粒（Control Plasmid），便於(yu) 觀察病毒包裝效率及測定病毒滴度。

(3) 高效轉染試劑（PolyShooter Transfection Reagent），具有更高的轉染效率和更低的細胞毒性。

(4) 常用病毒感染增強試劑Polybrene，能夠顯著提高病毒與(yu) 細胞的接觸及感染效率。

02/產(chan) 品組分

03/保存條件

冰袋（wet ice）運輸。-20℃ 保存，有效期12 個(ge) 月。

04/產(chan) 品特點

* 簡單快速——操作簡單，無需對包裝輔助質粒進行抽提，也無需對包裝體(ti) 係進行優(you) 化

* 病毒滴度高——可包裝出高滴度、高表達水平的慢病毒

* 應用範圍廣——經過設計及優(you) 化配比，兼容大多數慢病毒表達載體(ti)

05/實驗流程概要

06/實驗步驟

一、重組慢病毒製備

1. 細胞準備

轉染前一天，將4-6×106 個(ge) 293T細胞接種到10 cm細胞培養(yang) 皿中，使其在包裝時密度為(wei) 70%-80%，放置於(yu) 37℃，5% CO2培養(yang) 箱培養(yang) 16 h～24 h。

Ø 細胞狀態會(hui) 極大影響病毒包裝效率，待包裝細胞應處於(yu) 良好生長狀態，建議使用生長處於(yu) 指數期、存活率大於(yu) 90% 的細胞進行慢病毒包裝。

Ø 該包裝係統與(yu) ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line（CL110001）配合使用，可包裝出更高滴度、更高表達水平的慢病毒。

2. 慢病毒包裝

(1) 取10 μL慢病毒包裝輔助質粒混合物（Package Plasmid Mix）加入到2 mL離心管中，加入2.5 μg含有目的基因的慢病毒載體(ti) 質粒，輕輕混合，加入32 μL PolyShooter 轉染試劑與(yu) 質粒混合，室溫孵育3分鍾。

Ø 慢病毒載體(ti) 質粒需根據研究基因自行構建，應使用無內(nei) 毒素質粒抽提試劑盒進行質粒提取，保證質粒A260/A280比值為(wei) 1.8-2.0，濃度不低於(yu) 500 ng/μL。溶解後的質粒切忌反複凍融，需按照使用量進行分裝並於(yu) -20℃保存。

(2) 往上述混合物中加入1.8 mL無血清無雙抗的DMEM基礎培養(yang) 基，輕輕混勻，在室溫下靜置30分鍾，形成轉染試劑-核酸複合物。

Ø 轉染試劑-核酸複合物在室溫下4個(ge) 小時內(nei) 保持穩定。

(3) 將上述1.8 mL轉染試劑-核酸複合物輕輕地逐滴均勻加入10 cm皿293T細胞中，輕輕搖動培養(yang) 皿混勻，置於(yu) 37℃，5% CO2培養(yang) 箱中培養(yang) 產(chan) 毒。

3. 收獲病毒

(1) 轉染24 h後，可選擇棄去初始病毒上清液，加入10-15 mL新鮮的*培養(yang) 基(DMEM +10% FBS)至10 cm細胞培養(yang) 皿中，置於(yu) 37℃，5% CO2培養(yang) 箱繼續培養(yang) (此步驟可選)。

(2) 轉染48 h後，收集病毒上清液，再加入10-15 mL新鮮的*培養(yang) 基(DMEM +10% FBS)至10 cm細胞培養(yang) 皿中，置於(yu) 37℃，5% CO2培養(yang) 箱繼續培養(yang) 。

(3) 轉染72 h後，觀察細胞狀態並拍照，進行二次病毒上清液收集，與(yu) 48 h收集的上清液混合，300xg離心10分鍾以除去細胞碎片，使用0.22 μm濾器過濾，過濾後的上清液可直接感染目的細胞，或使用慢病毒濃縮試劑盒(LC110R)濃縮後感染目的細胞。

Ø 切忌反複凍融病毒，凍融一次病毒滴度將降低10-20%。-80℃保存的慢病毒最好在半年內(nei) 使用。

二、病毒滴度測定

1. 孔稀釋法標定帶熒光的重組慢病毒滴度

(1) Day1：準備細胞

對生長狀態良好的293T細胞消化計數後稀釋至
1-3x105個(ge) 
/mL
，加入96孔板，100
μL/孔（1-3x104個(ge) 
/孔），每⼀種慢病毒設6個(ge) 梯度孔，置於(yu) 37℃，5% CO2培養(yang) 箱中培養(yang) 。

(2) Day2：病毒的稀釋與(yu) 感染

在EP管中做10倍梯度稀釋，連續6個(ge) 稀釋梯度。稀釋方法如下：準備6個(ge) ⽆菌EP管，每個(ge) EP管中加⼊90μL 新鮮的*培養(yang) 基（含10 μg/mL polybrene），取待測定病毒液10 μL加⼊到第⼀個(ge) EP管中（標記10 μL），混勻後取10 μL病毒稀釋液加⼊到第⼆個(ge) EP管中（標記1 μL），以此類推，直到稀釋到最後⼀管。棄去96孔板中原有的培養(yang) 基，將稀釋好的病毒依次加入孔中，並做好標記，⼩⼼操作，不要吹起細胞，置於(yu) 培養(yang) 箱中培養(yang) 16 h。如需設置複孔，則按複孔的數量倍數增加以上用量。

(3) Day3：棄病毒，換液

吸去含病毒的培養(yang) 基，在每個(ge) 孔中再加入
100 μL
預熱的新鮮*培養(yang) 基。

(4) Day4：熒光計數與(yu) 滴度計算

方法1：末位稀釋計數法

感染36-48 h後，用熒光顯微鏡對熒光陽性細胞進行計數。數出最後兩(liang) 孔的熒光細胞數(若設置了複孔，則計算複孔內(nei) 的總數之和並計算出平均數)，假設為(wei) A(倒數第二孔的

熒光細胞數）和B（倒數第一孔的熒光細胞數)。

慢病毒滴度計算公式1：病毒滴度 (TU/mL) =（A+B×10）×1000/2/A孔病毒量（μL）

舉(ju) 例1：5號管對應的熒光陽性細胞數為(wei) 10個(ge) ，6號管對應的熒光陽性細胞數為(wei) 2個(ge) ，則病毒滴度為(wei) ：

滴度（TU/mL）=
（
10+2x10）x1000/2/0.001
=
1.5x107

如果需要感染
2x105個(ge) 細胞，MOI=5（1個(ge) 細胞對應5個(ge) 病毒顆粒），則需病毒體(ti) 積為(wei) ：

所需病毒體(ti) 積
=
2
x105x
5/1.5x107（mL）=
0.067
mL
=
67
μL

方法2：適量熒光計數法

感染36-48 h後，用熒光顯微鏡或流式細胞術對熒光比例合適（10%-50%）的連續兩(liang) 個(ge) 梯度進行統計，數出兩(liang) 孔的熒光細胞數(若設置了複孔，則計算複孔內(nei) 的總數之和並計算出平均數)，假設為(wei) C（較高濃度孔的熒光細胞數）和D（較低濃度孔的熒光細胞數）。

慢病毒滴度計算公式2：病毒滴度 (TU/mL) =（C+D×10）×1000/2/C孔病毒量（μL）

舉(ju) 例2：3號管對應的熒光陽性細胞數為(wei) 10000個(ge) ，4號管對應的熒光陽性細胞數為(wei) 2000個(ge) ，則病毒滴度為(wei) ：

滴度（TU/mL）=
（
10000+2000x10）x1000/2/0.1
=
1.5x108

如果需要感染
2x105個(ge) 細胞，MOI=30（1個(ge) 細胞對應30個(ge) 病毒顆粒），則需病毒體(ti) 積為(wei) ：

所需病毒體(ti) 積
=
2
x105x
30/1.5x108（mL）=
0.04
mL
=
40
μL

2. 相對定量PCR標定非熒光的重組慢病毒滴度

(1) Day1：準備細胞

對生長狀態良好的293T細胞消化計數後稀釋至1-3x105個(ge) 
/mL
，加入24孔板，500
μL/孔（
0.5-1.5x105個(ge) 
/孔），每⼀種慢病毒設6個(ge) 梯度孔，置於(yu) 37℃，5% CO2培養(yang) 箱中培養(yang) 。

(2) Day2：病毒的稀釋與(yu) 感染

在EP管中做10倍梯度稀釋，連續6個(ge) 稀釋梯度。稀釋方法如下：準備6個(ge) ⽆菌EP管，每個(ge) EP管中加⼊450μL 新鮮的*培養(yang) 基（含10 μg/mL polybrene），取待測定病毒液50 μL加⼊到第⼀個(ge) EP管中（標記50 μL），混勻後取50 μL病毒稀釋液加⼊到第⼆個(ge) EP管中（標記5 μL），以此類推，直到稀釋到最後⼀管。棄去24孔板中原有的培養(yang) 基，將稀釋好的病毒依次加入孔中，並做好標記，⼩⼼操作，不要吹起細胞，置於(yu) 培養(yang) 箱中培養(yang) 16 h。如需設置複孔，則按複孔的數量倍數增加以上用量。

(3) Day3：棄病毒，換液

吸去含病毒的培養(yang) 基，在每個(ge) 孔中再加入
500 μL
預熱的新鮮*培養(yang) 基。

(4) Day4：相對定量PCR與(yu) 滴度計算

用PBS清洗並將細胞吹打下來，離心收集細胞，進行基因組DNA的提取，qPCR檢測。以被測慢病毒載體(ti) 梯度稀釋為(wei) 標準品，慢病毒載體(ti) 上的通用引物進行qPCR以獲得病毒整合拷貝數。以Actin質粒梯度稀釋為(wei) 標準品，Actin引物進行qPCR檢測樣品的基因組拷貝數以得到基因組拷貝數。

慢病毒滴度計算公式3：滴度（IU/mL）=(E×N×1000)/對應孔病毒量（μL），其中E=平均每基因組慢病毒整合拷貝數，N=感染時細胞的數目（約為(wei) 1.5×105）。

Ø 測定時，設置一組帶熒光的已知TU的慢病毒作為(wei) 對照，以校驗檢測出的數值。

三、慢病毒感染目的細胞

VSVG包膜蛋白對不同的細胞和組織的親(qin) 嗜性有很大差異，在使用慢病毒感染目的細胞之前，需要查閱相關(guan) 文獻或進行預實驗確定目的細胞的複感染指數（MOI，multiplicity of infection）。

1. 按照上述步驟包裝慢病毒及確定慢病毒滴度，通過病毒滴度和MOI計算所需病毒量（計算公式參考06/實驗步驟/病毒滴度測定）。

2. 實驗前一天，將生長狀態良好的目的細胞消化計數後稀釋至1-3×105/mL，加入12孔板，1 mL/孔。放入37℃，5% CO2培養(yang) 箱中培養(yang) 。

Ø 懸浮細胞不需要提前一天接種，實驗前將細胞計數接種後，直接加入病毒混合液即可。

3. 配製慢病毒+polybrene+培養(yang) 基混合液。polybrene為(wei) 常用的促感染試劑，能夠顯著提高病毒與(yu) 細胞的接觸及感染效率，一般使用濃度為(wei) 2-10 μg/mL，但對某些細胞（如末端分化的神經元，DC細胞等）毒性較大，初次使用建議先做毒性測試。

4. 吸去12孔板中目的細胞的培養(yang) 基，加入3中配製的慢病毒混合液，放入37℃，5% CO2 培養(yang) 箱中繼續培養(yang) 。

Ø 感染懸浮細胞或半懸浮細胞，則需采用平角離心轉染法，即將適量的病毒液加入細胞培養(yang) 板後，封好口，放入平角離心機中，低速（200xg）離心
1 h
，然後放入培養(yang) 箱中繼續培養(yang) 。

Ø 若實驗條件有限，沒有平角離心機，可用離心管代替，將細胞吸入離心管中，進行低速離心，去掉大部分上清，加入適量的病毒液，室溫放置
15 min，然後將細胞和病毒液同時吸出轉入培養(yang) 板中繼續培養(yang) 。

5. 病毒感染16 h後更換為(wei) 新鮮培養(yang) 基繼續培養(yang) 。

6. 病毒感染36-48 h後，熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況。

7. 若表達效果不理想，可調整MOI（例如，設置MOI梯度）再次檢測。

07/適用範圍

兼容大多數慢病毒表達載體(ti) ，經過設計及優(you) 化配比，確保將重組子包裝成具有高感染率的慢病毒顆粒，同時防止病毒的自我複製。

08/注意事項

1. 該係統與(yu) ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line（CL110001）配合使用，可包裝出更高滴度、更高表達水平的慢病毒。

2. 在收獲粗病毒後，建議額外分裝幾支20-100 µL小體(ti) 積管，和其他分裝的大體(ti) 積病毒一並置於(yu) -80℃保存。待這些小體(ti) 積病毒結冰後，取出來融化，再測定滴度。這一步可以模擬一次凍融帶來的活性滴度下降，這樣測得的滴度才是真正具有參考價(jia) 值的。

3. 為(wei) 了您的健康安全，請規範操作，穿戴實驗服與(yu) 手套開展實驗。

4. 所有慢病毒操作均需在BSL2級生物安全櫃中進行。

5. 本產(chan) 品僅(jin) 供科研使用，請勿用於(yu) 臨(lin) 床診斷及治療。

09/實驗案例分析

1. 提前一天使用10 cm細胞培養(yang) 皿培養(yang) ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line（CL110001），待細胞密度為(wei) 75% 左右開始包裝慢病毒。

2. 使用ViralStars LP Lentivirus Packaging Kit（LP110-10）進行慢病毒包裝。取10 μL慢病毒包裝輔助質粒混合物（Package Plasmid Mix）加入到2 mL離心管中，加入2.5 μL表達GFP 的對照質粒（Control Plasmid），輕輕混合，加入32 μL PolyShooter轉染試劑與(yu) 質粒混合，室溫孵育3分鍾。

3. 往上述混合物中加入1.8 mL無血清無雙抗的DMEM基礎培養(yang) 基，輕輕混勻，在室溫下靜置30分鍾，形成轉染試劑-核酸複合物。

4. 將上述1.8 mL轉染試劑-核酸複合物輕輕地逐滴均勻加入10 cm皿慢病毒包裝細胞中，輕輕搖動培養(yang) 皿混勻，置於(yu) 37℃，5% CO2培養(yang) 箱中培養(yang) 產(chan) 毒。

5. 轉染24 h後，棄去初始病毒上清液，加入10 mL新鮮的*培養(yang) 基(DMEM +10% FBS)至10 cm細胞培養(yang) 皿中，置於(yu) 37℃，5% CO2培養(yang) 箱繼續培養(yang) 。

6. 轉染48 h後，收集病毒上清液，再加入10 mL新鮮的*培養(yang) 基(DMEM +10% FBS)至10 cm細胞培養(yang) 皿中，置於(yu) 37℃，5% CO2培養(yang) 箱繼續培養(yang) 。

7. 轉染72 h後，觀察細胞狀態並拍照，進行二次病毒上清液收集，與(yu) 48 h收集的上清液混合後，300xg離心10分鍾以除去細胞碎片，0.22 μm濾器過濾，使用ViralStars LC Lentivirus Concentration Solution慢病毒濃縮試劑盒（LC110R）進行20倍濃縮，使用1 mL ViralStars LS Lentivirus Storage Solution（LS110R）重懸慢病毒顆粒。

8. 孔稀釋法測定病毒滴度（參考06/實驗步驟中病毒滴度測定方法），使用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達情況，並拍照記錄，實驗結果如圖2所示。

10/其他相關(guan) 產(chan) 品

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