重組蛋白廣泛用於(yu) 生物學和醫學研究。由於(yu) 可用於(yu) 商業(ye) 用途的簡單方法的發展，重組蛋白的表達變得越來越普遍。最重要的是，它極大地增加了可以進行結構和生化研究的蛋白質數量。由於(yu) 每種蛋白質都是不同的，因此必須針對每種特定蛋白質開發純化方法和技術，同時牢記蛋白質的預期應用。
我們(men) 討論了影響的眾(zhong) 多參數蛋白質表達係統以及如何修改它們(men) 以提高它們(men) 在不同係統中的產(chan) 量。
重組蛋白到底是什麽？
重組蛋白被描述為(wei) “由重組DNA編碼的定製或修飾的蛋白"在合適的表達載體(ti) 中編碼所需基因的質粒在特定的宿主表達係統中表達，以產(chan) 生一定量的蛋白質用於(yu) 科學研究、治療或診斷目的。
重組蛋白的大量應用包括如下:
產(chan) 生重組蛋白需要將相關(guan) 基因複製到表達載體(ti) 中，同時受誘導型啟動子的調控。
然而，成功表達重組基因需要幾個(ge) 變量，包括正確的蛋白質折疊、細胞生長性狀以及轉錄和翻譯水平的適當表達指標。在細菌表麵展示重組蛋白在生物技術中有許多可能的用途；然而，這需要對通常在作為(wei) 融合伴侶(lv) 的載體(ti) 蛋白上發現的靶向基序有更深入的理解。
此外，選擇表達係統需要了解開發、維持和其他經濟因素的成本。
用於生產重組蛋白的表達係統
基因工程已經使在細菌、酵母、昆蟲、哺乳動物甚至動物體(ti) 內(nei) 生產(chan) 有價(jia) 值的重組蛋白成為(wei) 可能植物細胞。這種生物技術已經廣泛應用於(yu) 醫學，到2025年，其市場價(jia) 值預計將達到4000億(yi) 美元。
因為(wei) 每種宿主細胞都是不一樣的，所以不同的蛋白質表達方法產(chan) 生具有不同生物活性和穩定性水平的重組蛋白質並不罕見。糖蛋白包含超過50%的人類蛋白質和大約四分之一的工業(ye) 重組藥物蛋白質。為(wei) 了從(cong) 這些重組蛋白中提取最多的蛋白質，通常需要真核細胞作為(wei) 糖基化的宿主。
雖然大多數商業(ye) 生物仿製藥是使用中國倉(cang) 鼠卵巢(CHO)細胞製造的，但治療性重組蛋白的表達受到動物宿主細胞易受反饋抑製的限製。此外，昂貴的血清或生長因子的高製造成本和流行的動物感染的生物安全問題促使科學家們(men) 尋求非動物來源的真核細胞表達方法。由於(yu) 其有利的特征，包括低生產(chan) 成本、高生物安全性和蛋白質後修飾特征，植物細胞是合成藥物重組蛋白的優(you) 選。
由於(yu) 目前正在進行臨(lin) 床研究的許多生物製藥蛋白質，如治療性蛋白質、抗原和抗體(ti) 的有效表達，植物細胞表達係統已經獲得了國際關(guan) 注。然而，細菌表達係統仍然是商業(ye) 水平上的好係統。
細菌表達係統
說到生產(chan) 重組蛋白，大腸杆菌是常見的來源之一。雖然大部分重組蛋白是在大腸杆菌的細胞質中產(chan) 生的，但二硫鍵結合的重組蛋白經常是在周質中合成的。
氧化棲息地和駐留二硫鍵形成(Dsb)-係統可以通過將這些蛋白質導向周質來增強適當的二硫鍵。將周質用於(yu) 具有二硫鍵的重組蛋白更好，但是穿過細胞質屏障的靶向問題會(hui) 顯著降低周質產(chan) 量。
讓我們(men) 看看涉及的因素和條件蛋白質表達優(you) 化在細菌蛋白質係統中。
蛋白質序列和基因對可溶性和表達的影響
導致異源蛋白質不表達的一個(ge) 普遍因素是在感興(xing) 趣的mRNA中存在“奇怪的"密碼子。有可能通過密碼子增強的基因生產(chan) 來避免這種密碼子異常。基因合成的一個(ge) 好處是，它讓你改變基因的密碼子偏好，以便更好地與(yu) 雜交宿主合作。
用不常見的tRNAs加強的表達批次可以克服大腸杆菌重組基因中固有的密碼子異常。
表達產(chan) 量和溶解度都受到靶結構域起始和末端殘基的影響。通過分析蛋白質的結構和功能，我們(men) 可以找到構建蛋白質結構域的最佳位置。通過將感興(xing) 趣的蛋白質序列與(yu) 同源蛋白質結構相匹配，有可能確定結構域結構未知的蛋白質的合適結構域邊界。如果你沒有獲得同源蛋白質複合物的途徑，你應該使用二級解剖部分的預測。
載體對溶解性和表達的影響
DNA序列的某些部分，如Shine-Dalgarno盒、啟動子、調控序列、轉錄終止子、複製源等，控製所需基因的翻譯和轉錄。此外，選擇元件被整合到表達載體(ti) 中以促進質粒在靶細胞中的選擇。包含融合標簽是大腸杆菌表達載體(ti) 的另一個(ge) 基本部分。
當選擇啟動子框架時，應該考慮下遊應用和蛋白質靶類型。當處理潛在有害的蛋白質時，選擇基礎輸出水平較低的啟動子係統是明智的。另一方麵，為(wei) 了盡可能提高蛋白質產(chan) 量，必須選擇更有效的啟動子。對於(yu) 易於(yu) 聚集的蛋白質，可以考慮的一個(ge) 選擇是使用冷休克啟動子，允許在較低的溫度下表達。
來自細菌和其他更大的生物的蛋白質通常折疊更長時間並粘在一起。在大腸杆菌中，折疊催化劑和蛋白質伴侶(lv) 可以用來防止蛋白質粘在一起，同時使折疊更容易。兩(liang) 種蛋白質，一種在靶質粒上編碼，另一種在獨立的質粒上編碼，可以共表達。
融合標簽在基因水平上附著在特定的蛋白質上，使它們(men) 更易溶解或更容易被發現和純化。你通常必須嚐試幾種不同的標簽，才能知道哪種融合標簽能產(chan) 生最易溶解的蛋白質。此外，標簽的定位至關(guan) 重要，它可以位於(yu) 感興(xing) 趣的蛋白質的C-末端或N-末端。大多數融合涉及N-末端，這種融合有一個(ge) 優(you) 勢:與(yu) C-末端的對應蛋白相比，它通常提高了可溶性蛋白的表達。
考慮到融合標簽的可用性可能阻礙重組合成蛋白的生物學功能，在融合蛋白純化後酶促消除標簽可能是有用的。為(wei) 了便於(yu) 標簽的去除，建議整合一個(ge) 對給定序列*特的蛋白酶的分割部分。
宿主原種對異源蛋白表達的影響
細菌變體(ti) 宿主的發展可以促進異源蛋白質的合成。一些商業(ye) 銷售的大腸杆菌變異體(ti) 被改造成產(chan) 生具有特定特征的蛋白質，例如那些易受蛋白水解、具有不尋常密碼子或需要二硫鍵的蛋白質。
蛋白酶缺陷型變體(ti) ，如大腸杆菌BL21或該菌株的其他變體(ti) ，被推薦用於(yu) 易受蛋白水解破壞的蛋白質。當靶基因和表達宿主的密碼子頻率不同時，會(hui) 發生氨基酸誤摻入、翻譯過早終止和翻譯停滯。如果不尋常的tRNAs在表達過程中被提供，這種差異將成為(wei) 過去。使用具有編碼稀有tRNAs的質粒的細菌菌株，可以提高含有*特密碼子峰值頻率的基因的產(chan) 量。
通過在包括穀胱甘肽還原酶(gor)和硫氧還蛋白還原酶(trxB)的宿主菌株中表達，可以提高含有二硫鍵的折疊蛋白的溶解性，並有助於(yu) 胞質二硫鍵的產(chan) 生。大腸杆菌周質氧化性很強，有利於(yu) 二硫鍵的產(chan) 生；在這種環境中靶向產(chan) 生的蛋白質提供了表達含有二硫化物的蛋白質的替代技術。
通過調節表達增加蛋白質溶解度
使用有效的生產(chan) 啟動子和高濃度的誘導劑可以在折疊前發生蛋白質聚集。如果轉錄和翻譯速率降低，新生成的蛋白質在聚集之前將有更多的時間折疊。為(wei) 了提高蛋白質的溶解性，可以調整以下幾個(ge) 典型方麵的表達。
溫度:如果生產(chan) 溫度降低到15-25 ℃,重組產(chan) 生的蛋白質將更易溶解。降低的蛋白質收集、翻譯、轉錄和細胞分裂速率是由於(yu) 在較低溫度下細胞過程變慢。當表達特定蛋白質的溫度降低時，易受蛋白水解影響的蛋白質的分解速度減慢。
引發劑的效力:重組蛋白的溶解性和活性可以通過降低轉錄速率來增強，這可以通過降低誘導劑的濃度來實現。
選擇的媒介:最重組蛋白生產(chan) 通過分批培養(yang) 來培養(yang) 細胞。從(cong) 一開始就將所有必需的營養(yang) 物質加入到生長培養(yang) 基中是至關(guan) 重要的。
優化蛋白質的純化
- 固定化金屬親和色譜(IMAC)應該用作純化過程的第一階段。
- 當需要進一步純化時，使用凝膠過濾或尺寸排阻色譜法。必要時，離子交換色譜應該作為“純化"的最後一步
- 有可能刪除親和標簽以實現額外的純化並減少重組蛋白中存在的非原始序列的數量。
為大腸杆菌開發最佳表達係統
根據科學界目前的信息，建議開發一種適合大腸杆菌的表達係統是安全的。它應由促進有效轉錄、穩定轉錄物、使翻譯穩定、產(chan) 生真正的重組蛋白而不被截短或延伸的變體(ti) 汙染、保持溶解性並聚集到總細胞蛋白的約20%的DNA成分組成。
這種類型的表達整合了管家啟動子s70所確認的共有啟動子，並且它可以通過整合UP元件而經曆額外的改善。誘導相鄰基因的通讀轉錄受到兩(liang) 個(ge) 缺乏任何因子的強轉錄終止子的串聯排列的阻礙。
在轉錄物兩(liang) 端發現的反向重複穩定了轉錄物本身。這些重複序列可以產(chan) 生莖環結構，阻礙5’端的核酸內(nei) 切酶活性和3’端的核酸外切酶破壞，但它們(men) 不抑製翻譯。最後，彈性Shine-Dalgarno序列、下遊8bp的AUG起始密碼子和延長的UAAU終止密碼子確保了有效的翻譯。折疊分子伴侶(lv) 隨著新的多肽鏈同時表達，幫助它們(men) 折疊。
然而，有必要指出這樣一個(ge) 結論，即所有的重組蛋白都沒有一種*美生產(chan) 方法。每種蛋白質都有其挑戰。為(wei) 了實現高度的合成，有必要通過係統地調整各種參數來優(you) 化每種情況下的工藝。
結論
出於(yu) 生物技術、醫學和實驗目的，科學家采用許多策略來調節蛋白質的表達。與(yu) 非常容易製造的DNA不同，蛋白質隻能由細胞或活組織的複雜混合物製造。通過特定表達係統生產(chan) 重組蛋白的努力可能會(hui) 從(cong) 令人滿意且相對快速的操作迅速轉變為(wei) 緊張且耗時的過程。通過上述步驟，研究人員和科學家可以使用重組蛋白表達服務來克服這些障礙。
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