使用Elisa試劑盒檢測細胞因子的最終指南

在現代生物技術中，當確定生物樣品中抗原、抗體(ti) 、肽、蛋白質、激素或其他生物分子的存在和數量時，酶聯免疫吸附測定(ELISA)被廣泛使用。由於(yu) 其高靈敏度，它甚至可以識別最小的抗原濃度。

ELISA的敏感性歸因於(yu) 其識別單一抗原-抗體(ti) 複合物之間相互作用的能力。

Elisa試劑盒在持續的變化中的醫學研究和診斷領域。由於(yu) 其非凡的準確性和適應性，這些試劑盒對於(yu) 解決(jue) 醫學謎題和研究新的治療方法是需要的。隨著科學好奇心和技術進步，它們(men) 的使用已經擴展到包括從(cong) 傳(chuan) 染病到癌症生物標記識別的各個(ge) 領域。他們(men) 每天都有新的突破，幫助改善病人護理和革命性的醫學進步。

酶聯免疫試劑盒在細胞因子檢測中的應用

這ELISA技術包括各種免疫測定，它們(men) 的程序幾乎沒有區別。幾個(ge) 參數，例如被檢測的抗原、可用於(yu) 特定抗原的單克隆抗體(ti) 以及必要的測試靈敏度，決(jue) 定了使用哪種版本的ELISA。夾心法和間接ELISA是細胞因子檢測中常用的兩(liang) 種方法。

1.夾心ELISA

細胞因子夾心ELISAs是敏感酶免疫測定其可以精確地鑒定和測量可溶性趨化因子和細胞因子蛋白的量。高純度的抗細胞因子抗體(ti) (捕獲抗體(ti) )用於(yu) 基本的細胞因子夾心ELISA方法。這些抗體(ti) 非共價(jia) 吸附在塑料微孔板上。固定的抗體(ti) 用於(yu) 選擇性地結合在樣品中發現的可溶性細胞因子蛋白，所述樣品在洗板後加入到板上。

去除未結合的物質後，使用生物素偶聯的抗細胞因子抗體(ti) (檢測抗體(ti) )來鑒定已經收集的細胞因子蛋白。隨後是酶標記的抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白步驟。

一；一個(ge) ELISA閱讀器可用於(yu) 在加入生色底物後，在可接受的光密度(OD)下，通過分光光度法簡單地定量由結合的酶聯檢測試劑產(chan) 生的有色產(chan) 物的量。當板閱讀器連接到計算機時，數據存儲(chu) 和再分析變得更容易。

這ELISA夾心法是高精度測量分析物的方法。這種形式可以揭示分析物的特異性和靈敏度，從(cong) 固定分析物的捕獲抗體(ti) 開始。當加入帶有酶標記的檢測抗體(ti) 時，三明治就像積木一樣組裝起來了。它通過識別分析物上的額外表位來完成複雜的三明治結構。

2.間接ELISA

間接ELISA是一種二級結合抗體(ti) 鑒定一級抗原特異性抗體(ti) 的方法。抗體(ti) 測序協調間接Elisa中的靈敏度和信號放大。在這種結構中，兩(liang) 種抗體(ti) 協同工作來擊敗分析物。具有高特異性的第一抗體(ti) 尋找分析物並形成不可逆的結合。

第二抗體(ti) 然後使用酶標記來識別並將其自身附著到原始抗體(ti) 上。兩(liang) 種抗體(ti) 協同作用，增強了信號，提高了靈敏度，即使是極微量的分析物也能突顯出來。

當用於(yu) 細胞因子檢測時，間接ELISA的靈敏度高。這主要是因為(wei) 第一抗體(ti) 可以附著許多與(yu) 酶結合的第二抗體(ti) 。此外，一種酶偶聯的二抗可以識別多種一抗。這為(wei) 用戶提供了根據需要在幾個(ge) ELISA中使用相同的酶偶聯的第二抗體(ti) 的選擇(獨立於(yu) 被檢測的抗原)

選擇合適的ELISA試劑盒

考慮以下因素將有助於(yu) 您的ELISA試劑盒發揮最佳性能:

1.抗體的特異性

這為(wei) ELISA測試選擇抗體(ti) 取決(jue) 於(yu) 特異性和親(qin) 和性標準。根據定義(yi) ，單克隆抗體(ti) 結合更精確，減少了背景信號。多克隆和單克隆可以一起使用，也可以分開使用。盡管多克隆會(hui) 產(chan) 生更高的信號，但非特異性結合也會(hui) 更普遍。您還需要每次都進行廣泛的測試，因為(wei) 多克隆會(hui) 表現出更多的批次間差異。

術語“配對"描述單克隆抗體(ti) 、多克隆抗體(ti) 或兩(liang) 種抗體(ti) 的混合物，用於(yu) 在實驗中檢測單一抗原。這些抗體(ti) 應該已經通過與(yu) 幾個(ge) 表位結合並作為(wei) 有效的“捕獲"和“檢測"對而表現出良好的功能。

2.靈敏度和檢測範圍

每個(ge) ELISA試劑盒都設計用於(yu) 檢測不同的目標，並具有好的功能；它們(men) 不是普遍適用的。了解您的ELISA試劑盒的靈敏度和特異性，以及每一步的精確增強，將提供準確可靠的標準曲線，顯示您目標的測量結果。

每個(ge) 包裝中將包含針對每個(ge) 目標定製的試劑和ELISA緩衝(chong) 液。在測試開始時，確保您了解每組參數，如抗體(ti) 類型、孵育持續時間、溫度和報告係統。如果你事先熟悉這一點，它會(hui) 節省你大量的時間和煩惱。

3.樣本兼容性

了解特定的ELISA試劑盒是否與(yu) 您的樣品組成(基質)相容(或不相容)。試劑盒的性能通常使用各種矩陣進行評估，結果經常出現在說明書(shu) 和其他輔助材料中。確保您了解ELISA試劑盒在樣本(尿液、組織培養(yang) 、血漿、血清等)的基質中的描述。).雖然這並不一定意味著試劑盒不起作用，但它將有助於(yu) 了解您是否需要更多的驗證分析來確定它在您的興(xing) 趣矩陣中的表現如何。

4.驗證和質量控製

使用質控樣本在以下位置進行一些測試生成標準曲線的各種稀釋度充分利用你的裝備。當你知道合適的稀釋度時，保存好你的樣品。在了解要使用的樣品和稀釋液後，您可以有效地安排您的樣品板。確保按照試劑盒的說明使用所有孔。如果根據給出的信息需要額外的檢測試劑，請添加。

實驗協議

在生成有價(jia) 值和有意義(yi) 的數據時，以準確性和可重複性為(wei) 目標。始終牢記ELISA方案，以確保一致性、最佳性能和精確結果。以下是需要考慮的實驗方案:

• 在開始實驗之前，給試劑盒試劑大約30分鍾的時間，使其達到室溫或規定的溫度。
• 此外，冷凍樣品必須全解凍，凍融循環次數應保持在低水平，不超過三次。
• 在實驗期間和實驗之間保持一致的環境條件，如溫度和濕度。
• 確保每一件設備，如閱讀器、

  洗板機和移液器已校準.

• 使用足夠的抗體。
• 使用新製備的底物溶液，在使用前儲存數小時。
• 在測試過程中，始終如一地處理樣品，並遵守相同的方案。
• 在操作過程中目視檢查吸頭和孔，以確保吸取、試劑添加和提取。水平應該是一樣的。
• 為了更好地利用您的試劑，請在ELISA檢測中混合批次。每個ELISA試劑盒被組裝成使得組件作為一個單元起作用。測試之間的大量混合可能會對結果產生負麵影響。
• 試劑一旦使用，切勿放回瓶中。
• 測試後，保持托盤關閉，以防止孔變幹。

成功檢測細胞因子的技巧

1.樣品製備

在開始你的主要實驗之前，用一個(ge) 小樣本來確定合適的稀釋範圍。您的樣本必須符合微量滴定板測試的格式。被檢測的生物標記物的數量總會(hui) 有變化。

由於(yu) 您正在尋找符合樣品標準曲線的數據，請使用試劑盒說明作為(wei) 指南。請注意，含有膽紅素或其他幹擾因素的樣本會(hui) 導致錯誤的結果。以下樣品可用於(yu) ELISA試劑盒:細胞裂解物、血清、唾液、血漿和細胞培養(yang) 上清液。

2.已知濃度的滴定標準

確定濃度的滴定ELISA標準對於(yu) 任何ELISA都是不可少的，因為(wei) 它們(men) 使用戶能夠確定抗原濃度在測試樣本中。為(wei) 了建立標準曲線，通常要留出一係列的孔，並加入已知量的a將純化的重組蛋白逐漸加入孔中.

然後，當這些孔與(yu) 測試樣品同時處理時，用戶可以從(cong) 酶標儀(yi) 獲得已知蛋白質濃度的一組參考吸光度值，以便與(yu) 測試樣品的吸光度值一起使用。

之後，您可以計算標準曲線，與(yu) 測試樣品進行比較，以確定所需蛋白質的濃度。也可以使用標準曲線來驗證用戶進行稀釋的準確度。

3.添加底物

孔中酶的量與(yu) ELISA底物被轉化為(wei) 產(chan) 品。最常見的附著在抗體(ti) 上的酶是堿性磷酸酶和辣根過氧化物酶。正如可以假設的那樣，可以獲得針對每種酶定製的產(chan) 生熒光或生色產(chan) 物的各種底物。

此外，底物具有多種靈敏度，這可能會(hui) 提高檢測的總靈敏度。當選擇合適的底物和酶偶聯抗體(ti) 時，您還必須考慮在實驗結束時讀取ELISA板的設備。

4.檢測和分析

一種計算ELISA靈敏度的常規方法是選擇產(chan) 生比平均背景信號值高至少兩(liang) 到三個(ge) 標準偏差的信號的*低濃度的細胞因子。

特定的細胞因子和趨化因子蛋白存在於(yu) 混合的細胞因子環境中，例如刺激的淋巴細胞培養(yang) 上清液。因此，由於(yu) 檢測抗體(ti) 信號的酶介導的擴增，夾心ELISA可以定量這些蛋白質的生理相關(guan) 量。

如何分析ELISA數據

1.成績統計

在ELISA過程中，未知樣品的值通過與(yu) 標準曲線進行比較來確定。在樣品稀釋的情況下，稀釋係數需要乘以從(cong) 標準曲線獲得的濃度值。ELISA樣品應總是一式三份或兩(liang) 份，以提供具有足夠數據的結果進行統計驗證。

對於(yu) 每個(ge) 標準品、對照品和樣品，計算兩(liang) 次或三次測量值的平均值，並減去平均零標準光密度(OD)。重複數據的變異係數(CV)不應超過20%。

2.標準曲線

使用計算機軟件繪製平均吸光度對蛋白質濃度的曲線，以創建標準曲線。確保您遵循ELISA試驗協議建議的數據簡化技術。

已知濃度的標準細胞因子蛋白質溶液被連續稀釋以產(chan) 生標準曲線，該標準曲線被添加到夾心ELISA測試中。這些標準曲線也稱為(wei) “校準曲線"它們(men) 通常是通過將標準細胞因子蛋白濃度(通常表示為(wei) ng或pg細胞因子/ml)對相應的重複平均OD值作圖而得到的。

可以從(cong) 標準曲線推斷出可疑的含細胞因子樣品的濃度。ELISA計算機軟件程序有助於(yu) 這一操作。為(wei) 了確保OD位於(yu) 標準曲線的線性區域內(nei) ，請確保對未知樣品進行一係列稀釋。研究人員可以選擇對他們(men) 的數據進行各種曲線擬合分析，如線性對數、對數對數或四參數轉換，這取決(jue) 於(yu) 所用的ELISA試劑的種類。

如果軟件不可用，可通過在線性標度上繪製濃度記錄與(yu) OD記錄的圖表，使ELISA數據分析線性化。回歸分析可用於(yu) 找到最佳擬合線。該過程將產(chan) 生足夠的但不太精確的數據擬合。

3.計算變異係數

變異係數(CV)描述了標準偏差與(yu) 平均值的比率，通常用百分比表示。CV計算至關(guan) 重要，因為(wei) 它可能會(hui) 揭示ELISA數據中的任何差異或錯誤。重複數據的變異係數(CV)不應超過20%。更高的簡曆意味著更多的不準確和潛在的錯誤。

ELISA常見問題的故障排除

每種ELISA都有一定的缺點。首先，測試樣本中存在多少目標蛋白質的問題。如果數量過高或過低，酶標儀(yi) 產(chan) 生的吸光度讀數可能會(hui) 分別超出或低於(yu) 標準曲線的極限。因此，估計測試樣品中蛋白質的精確數量將是一個(ge) 挑戰。

如果讀數非常高，在將測試樣品放入板的孔中之前稀釋它。根據稀釋係數，必須修改最終數字。DIY試劑盒有時需要仔細優(you) 化抗體(ti) 濃度，以獲得良好的信噪比。

結果

各種ELISA技術已被改進，以定量分析不同實驗標本中的抗原水平。然而，它們(men) 背後的基本思想都是一樣的。在選擇是采用間接ELISA還是夾心ELISA時，待檢樣品的複雜性和抗原特異性抗體(ti) 的可用性是關(guan) 鍵考慮因素細胞因子檢測.

當確定免疫反應的結果時，例如計算樣品中抗體(ti) 的含量，可以使用間接ELISA。當檢查複雜樣品時，其中分析物或靶抗原存在於(yu) 混合樣品中，如組織裂解物或培養(yang) 上清液，夾心ELISA是最合適的方法。