使用 Pico488 進行 DNA 定量

Pico488 DNA 定量溶液是一種超靈敏試劑，用於(yu) 在無法通過測量 260 nm 吸光度來確定雙鏈 DNA 濃度時測量雙鏈 DNA 濃度。 Pico488 選擇性地結合雙鏈 DNA，因此核苷酸、單鏈 DNA、RNA、蛋白質和其他雜質不會(hui) 妨礙測量。與(yu) 雙鏈 DNA 結合的染料在 503 nm 處最大吸收光並在 525 nm 處最大發射光。為(wei) 了檢測測定讀數，可以使用任何類型的熒光計或熒光板讀數器。

Pico488 測量 DNA 濃度的線性範圍為(wei) 1 pg/μL — 5 ng/μL。為(wei) 了實現精確、可重複的熒光測量，我們(men) 建議在 TE 緩衝(chong) 液（10 mM Tris-HCl，pH 7.5，1 mM EDTA）中稀釋 DNA 和 Pico488。為(wei) 了計算 DNA 濃度，我們(men) 建議首先使用一係列 DNA 標準稀釋液建立校準曲線。

Lumprobe 銷售各種包裝的Pico488 DNA 定量溶液和Pico488 DNA 定量試劑盒。除了 Pico488 溶液之外，該試劑盒還包括緩衝(chong) 液和 DNA 標準儲(chu) 備溶液。如果測定體(ti) 積等於(yu) 2 ml，則試劑盒提供的染料溶液量足以分析標準熒光比色皿（體(ti) 積 3.5 ml）中的 200 個(ge) 實驗數據點。如果使用其他類型的設備來檢測熒光，則可以重新調整測定範圍。下表提供了常用熒光設備的推薦檢測體(ti) 積。

協議

1. Pico488工作液的製備

解凍 Pico488 染料瓶中的內(nei) 容物，充分混合，並用緩衝(chong) 液將所需量的 Pico488 染料溶液稀釋 200 倍（我們(men) 建議使用 10 mM Тris HCl、1 mM EDTA，pH 7.5）。混合並在3小時內(nei) 使用。每個(ge) 實驗數據點的 Pico488 工作溶液體(ti) 積應等於(yu) 測定體(ti) 積的 50%（查看下表以查找適合您的熒光測定設備類型的推薦體(ti) 積）。為(wei) 所有實驗數據點（針對您計劃分析的所有樣品和所有 DNA 標準稀釋液）準備足夠的 Pico488 工作溶液。還包括額外 10-25% 的 Pico488 工作溶液體(ti) 積，以排除可能的移液錯誤。要計算稀釋後的 Pico448 的體(ti) 積，可以使用以下公式：

V Pico488 = 5/8 × V測定× (N 個(ge) 樣品+ N 個(ge) 標準品)， 其中 V測定是樣品或標準品的測定體(ti) 積，mL，N 個(ge) 樣品 是您計劃分析的樣品數量，N 個(ge) 標準品是您計劃分析的標準品數量（包括空白樣品）。

2. 樣品溶液的製備

在緩衝(chong) 液中稀釋 DNA 樣本，使溶液體(ti) 積等於(yu) 測定體(ti) 積的 50%（您可以使用任意量的 DNA）。添加等體(ti) 積的 Pico488 工作溶液。混合並孵育 5 分鍾。同樣，製備 DNA 標準品的稀釋液。請注意，DNA 標準品的稀釋度應在樣品中 DNA 濃度的範圍內(nei) 。 DNA 標準儲(chu) 備液僅(jin) 隨Pico488 DNA 定量試劑盒提供。Pico488 DNA 定量解決(jue) 方案的用戶 應使用自己的 DNA 標準品。

使用Pico488 DNA 定量溶液進行 DNA 定量的推薦體(ti) 積：

* 為(wei) 了保持測量的準確性和精密度，我們(men) 建議避免移液量低於(yu) 2 µL。

3. 熒光測量

使用適當的吸收和發射波長或濾光片測量標準和樣品 DNA 溶液的熒光（雙鏈 DNA 結合的 Pico488 染料吸收最大波長為(wei) 503 nm 的光，發射最大波長為(wei) 525 nm 的光）。

4. DNA濃度的計算

繪製熒光與(yu)  濃度的關(guan) 係圖，並在任何軟件中應用線性回歸函數，以獲得反映熒光 ( FL ) 與(yu) 濃度 ( C ) 依賴性的線性方程：
FL = A × C + B。

要計算稀釋樣品中的 DNA 濃度，請使用以下公式：
C樣品= (FL樣品 — B)/A，其中FL樣品是樣品溶液熒光。

要計算未稀釋樣品中的 DNA 濃度，請使用以下公式：
С init = V Assay × C Sample  / V init，其中 V Assay是測定體(ti) 積（mL），V init是初始 DNA 樣品的體(ti) 積（μL）

或者，您可以使用我們(men) 的dsDNA 定量和稀釋 計算器完成所有必要的計算。

線性回歸示例：熒光與 DNA 濃度