蛋白質和其他硫醇化生物分子的馬來酰亞胺標記

硫醇與(yu) 馬來酰亞(ya) 胺的反應是廣泛用於(yu) 生物共軛和標記生物分子（包括蛋白質和肽）的過程。它按照以下方案進行：

馬來酰亞(ya) 胺是對硫醇表現出高選擇性的親(qin) 電子化合物。雖然馬來酰亞(ya) 胺在自然界中幾乎不存在，但硫醇卻非常豐(feng) 富。它們(men) 以半胱氨酸殘基形式存在於(yu) 蛋白質和肽中。盡管天然DNA不含硫醇，但具有硫醇基團的合成寡核苷酸可以很容易地製備。

硫醇易於(yu) 氧化二聚並形成二硫鍵。因此，半胱氨酸殘基形成二硫鍵，從(cong) 而穩定蛋白質的三級結構。二硫化物不與(yu) 馬來酰亞(ya) 胺反應。因此，有必要在綴合前還原二硫化物並排除反應中的氧氣。

綴合方案取決(jue) 於(yu) 起始組分的溶解度。對於(yu) 水溶性較低的化合物（如大多數熒光染料馬來酰亞(ya) 胺），必須使用有機共溶劑（如 DMSO或 DMF）。

我們(men) 建議采用以下方案將Lumprobe 染料馬來酰亞(ya) 胺與(yu) 蛋白質、肽和其他硫醇化生物分子結合。

1. 將待標記的蛋白質或其他含有硫醇的分子溶解在塑料小瓶中的脫氣緩衝(chong) 液中，pH 7-7.5（PBS、Tris 和 HEPES 很好，但也可以使用其他不含硫醇的緩衝(chong) 液）。可以通過在緩衝(chong) 液上施加真空幾分鍾或通過惰性氣體(ti) （氮氣、氬氣或氦氣）鼓泡來對緩衝(chong) 液進行脫氣。對於(yu) 蛋白質，最佳濃度為(wei) 1-10 mg/mL。

2. 添加過量的 TCEP（三羧乙基膦）試劑以減少二硫鍵，用惰性氣體(ti) 衝(chong) 洗並關(guan) 閉。 TCEP 過量 100 倍就可以了。將混合物在室溫下放置 20 分鍾。

3. 將馬來酰亞(ya) 胺染料溶解在 DMSO 或新鮮 DMF 中（100 uL 中 1-10 mg）。

4. 將馬來酰亞(ya) 胺染料溶液添加到硫醇溶液中（染料過量 20 倍），用惰性氣體(ti) 衝(chong) 洗小瓶，然後緊緊關(guan) 閉。

5. 充分混合並在 4°C 或室溫下放置過夜。

6. 通過凝膠過濾、HPLC、FPLC 或電泳純化產(chan) 物。

對於(yu) 水溶性差的馬來酰亞(ya) 胺，像大多數染料馬來酰亞(ya) 胺一樣，我們(men) 建議使用共溶劑（DMF 或 DMSO）。具有良好水溶性的馬來酰亞(ya) 胺（如磺基-氰基馬來酰亞(ya) 胺）可以溶解在水中。如果出現沉澱，請增加混合物中有機助溶劑的含量，以實現更好的標記。

建議僅(jin) 將透析作為(wei) 純化具有良好水溶性的馬來酰亞(ya) 胺的方法。