炔烴修飾的寡核苷酸與染料疊氮化物的綴合

點擊化學緩衝(chong) 液適用於(yu) 含有炔烴的寡核苷酸的合成後綴合。帶有末端炔的寡核苷酸可以使用炔亞(ya) 磷酰胺合成，或者您也可以在我們(men) 的網站上訂購修飾寡核苷酸的合成。

疊氮化物與(yu) 修飾寡核苷酸的末端炔綴合，形成五元雜環。這兩(liang) 個(ge) 基團（疊氮基和炔烴）在天然生物分子中都極為(wei) 罕見，因此該反應具有高度特異性，可以有效地處理各種任務。

該反應在銅 (I) 存在下、中性 pH 值下進行。催化緩衝(chong) 液含有銅 (II)、醋酸三乙銨 pH 7 和 DMSO。建議使用新配製的 抗壞血酸溶液來還原銅 (II)。

對於(yu) 此反應，您將需要炔烴修飾的寡核苷酸、疊氮化染料、點擊化學緩衝(chong) 液和抗壞血酸。您可以在我們(men) 的網站上在線訂購所有試劑。

協議

我們(men) 推薦以下方案用於(yu) 含炔寡核苷酸與(yu) 疊氮化染料的綴合：

1. 根據要使用的寡核苷酸的量確定總反應體(ti) 積：

   寡核苷酸的量	總反應體積，μL
   4至20納摩爾	100
   20至40納摩爾	200
   40至80納摩爾	400
   80 至 600 納摩爾	600

2. 使用下表計算標記反應的試劑體(ti) 積：

   試劑	體積，微升	原液濃度
   疊氮化染料	(寡核苷酸量[nmol])×0.15	10 mM DMSO 溶液
   點擊化學緩衝液	（總反應體積[μL]）×0.67	1.5倍
   活化劑 （抗壞血酸）	（總反應體積[μL]）×0.02	50 mM 水中
   水（用於溶解寡核苷酸）	（總反應體積 [μL] - 疊氮化染料溶液的體積 [μL] - 緩衝液的體積 [μL] - 活化劑溶液的體積 [μL]）	—

3. 準備疊氮化染料（DMSO 中 10 mM）和活化劑（抗壞血酸，水中 50 mM） 的儲(chu) 備溶液 。

   請記住，抗壞血酸在空氣中很容易氧化。僅(jin) 使用新配製的活化劑溶液（該溶液在 1 天內(nei) 穩定）。要製備儲(chu) 備溶液，請將 10 mg抗壞血酸溶解在 1.1 mL 水中。

4. 將寡核苷酸溶解在 2 mL 塑料管中 計算體(ti) 積的 水中。

5. 添加點擊化學緩衝(chong) 液和渦旋。

6. 添加計算體(ti) 積的疊 氮化染料儲(chu) 備溶液並再次渦旋。

7. （受到推崇的）。將混合物脫氣以除去氧氣。為(wei) 此，將一次性移液器吸頭連接到塑料或矽膠管，該管連接到裝有惰性氣體(ti) （氬氣、氮氣或氦氣）的氣瓶的壓力調節器。打開非常弱的氣流並將頭部放入管中，使其比液位高 3-10 毫米，避免接觸液體(ti) 和管壁。氣流應在液體(ti) 中形成漩渦而不濺出液體(ti) 。將頭部保持在該位置 10-20 秒。

   如果同時運行多個(ge) 標記反應，則可以使用 SpeedVac 型係統進行脫氣。為(wei) 此，將管子放入係統中，打開旋轉，打開真空 30-40 秒，然後關(guan) 閉真空，同時向係統輸入端注入惰性氣體(ti) 。

8. 添加活化劑溶液（抗壞血酸），然後用惰性氣體(ti) 吹掃管幾秒鍾並關(guan) 閉它。

9. 渦旋溶液。如果反應過程中形成沉澱，請將管在熱水 (70–95 °C) 中加熱，直至沉澱溶解並渦旋溶液。

10. 讓混合物在室溫下靜置 8-16 小時。

11. 添加 2M 高氯酸鋰溶液（每 5 體(ti) 積的反應混合物 1 體(ti) 積），渦旋溶液，並添加額外的純丙酮至 2 mL。

12. 搖動管子並使其在-20°C 下靜置 20 分鍾。

13. 以 10,000 RPM 離心 10 分鍾，分離沉澱物。丟(diu) 棄上清液。

14. 將 1 mL 丙酮添加到沉澱物中。搖動管數次，並以 10,000 RPM 離心 10 分鍾分離沉澱物。丟(diu) 棄上清液。

15. 讓沉澱物在室溫下在開口管中幹燥 1 小時或將管放入 65°C 的加熱塊中 10 分鍾。

16. 將沉澱物溶解於(yu) 水中，並通過HPLC純化目標產(chan) 物