如何進行ELISA的構建？

選擇您的關鍵試劑

固相：應選擇專門允許結合檢測中的抗原或抗體成分的固相以避免背景噪音。可用固相的例子有微孔板（通常是聚苯乙烯、聚丙烯和聚乙烯）、小管和珠子。小管和珠子通過提供較低的檢測限來擴展測定參數。這是因為它們允許靈活的測試數量和測定體積，同時還為塗層和反應的發生提供更大的表麵積。珠子的使用可以進一步減少孵育時間，並使 ELISA 能夠用於不同的微流體係統，即自動化台式 ELISA。珠子本身可以是磁性的，因此使用磁鐵可以輕鬆地將其分布在整個液相中。

樣本：

應選擇具有已知分析物濃度的標準樣品，以涵蓋從(cong) 檢測下限到上限（校準）的整個(ge) 測定範圍。這是為(wei) 了確保無論樣品中可測量的分析物濃度較低還是較高，測定的靈敏度和精確度都是一致的。此外，患者樣本應取自並包含各種年齡範圍、種族、性別和健康狀況，以確保檢測的廣泛適用性和可靠的結果。在定量之前和定量過程中保持目標分析物穩定對於(yu) 準確測定濃度至關(guan) 重要。因此，樣品提取、製備和儲(chu) 存中涉及的以下分析前條件尤其重要。

• 必須選擇能夠保持分析物穩定性的適當樣品基質。

• 可能需要將蛋白酶抑製劑添加到生物流體(ti) 樣品基質中，以防止天然存在的蛋白酶降解分析物。

• 收集患者樣本時，必須評估運動、禁食、酒精、煙草和季節變化的影響。

• 必須確定最佳樣品儲(chu) 存溫度（-80° C、-20° C、2-8° C 或室溫）和凍融循環次數

• 必須研究樣品在室溫下放置並在檢測環境中保持穩定的時間長度。 

• 移液前必須以標準化方式充分混合或倒置樣品，以確保分析物在整個(ge) 樣品基質中均勻分布。

洗滌緩衝液

洗滌緩衝(chong) 液的目的是洗掉任何未結合或過量的物質，否則可能會(hui) 產(chan) 生背景噪音信號並幹擾測定和結果。洗滌緩衝(chong) 液的設計具有與(yu) 生理條件相似的 pH 值和鹽濃度，並含有TRIS ( FT15751 )、PBS 和聚山梨酯等洗滌劑。如果檢測到大量“背景噪音"而不是信號強度，則增加洗滌緩衝(chong) 液的體(ti) 積、洗滌劑的濃度或/和洗滌步驟的數量通常會(hui) 有所幫助。這將增加所有未結合材料被去除的可能性。如果懷疑分析物降解或者分析物在程序中被洗掉，則減少洗滌步驟數、洗滌緩衝(chong) 液體(ti) 積或緩衝(chong) 液中去汙劑的濃度可能是有益的。

封閉緩衝液

為(wei) 了防止與(yu) 其他檢測成分發生交叉反應和非特異性抗原結合，需要使用封閉劑。通常將牛奶溶液（脫脂奶粉）、全血清或牛血清白蛋白 (BSA) ( PRO-422 ) 等試劑添加到緩衝(chong) 液中，並在第一次洗滌步驟後使用，以飽和孔的自由表麵。

這種封閉緩衝(chong) 液也可以含有去汙劑，但應避免使用可能幹擾測定的生物素或免疫球蛋白等成分。總體(ti) 封閉緩衝(chong) 液可以獲得更高的信噪比，並且可以在使用的封閉劑的體(ti) 積、濃度和類型方麵進行優(you) 化。

酶和底物（信號係統）

常用的信號係統之一是酶聯抗體(ti) ，並且有多種不同形式和物種類型可供選擇。常用於(yu) ELISA，其中堿性磷酸酶和磷酸對硝基苯酯底物在目標分析物存在的情況下會(hui) 產(chan) 生黃色。檢測抗體(ti) 還可以與(yu) 過氧化物酶並與(yu) 氨基水楊酸和鄰苯二胺底物一起使用，如果出現陽性結果，它們(men) 會(hui) 呈現棕色。總體(ti) 酶反應用於(yu) 證明反應的特異性和速率。信號出現後，可以添加氫氧化鈉、鹽酸或硫酸來終止反應。 

在測定開發過程中，性能和財務方麵在確定應使用哪些試劑以及濃度時起著關(guan) 鍵作用。雖然使用較低濃度的酶聯抗體(ti) 可能更具成本效益，但可能有必要增加濃度以確保產(chan) 生足夠的信號強度。如果您的 ELISA 靈敏度較差，可以通過改變抗體(ti) 類型（從(cong) 單克隆抗體(ti) 到多克隆抗體(ti) ）或采用不同的信號係統來放大信號。第一個(ge) 例子是二抗被生物素化，然後添加鏈黴親(qin) 和素-HRP。由於(yu) 四個(ge) 鏈黴親(qin) 和素分子可以與(yu) 生物素相互作用，因此通過添加更多的鏈黴親(qin) 和素分子進行檢測，可以提高檢測少量分析物的能力。此外，通過用多種酶、銀納米顆粒標記檢測抗體(ti) 或使用化學發光或熒光底物等替代底物類型，可以提高靈敏度。 

校準和控製

標準曲線或校準曲線由分布在測定範圍內(nei) 的已知分析物濃度的樣品組成。它們(men) 在 ELISA 中用作輔助，以便稍後計算目標分子的濃度。應該強調的是，校準品和對照品的矩陣應盡可能與(yu) 所運行的天然樣品的矩陣相似。

運行標準曲線很有用，如果生成的標準曲線較差，可能會(hui) 導致結果無效或突出檢測中的錯誤。不正確的抗體(ti) 結合或分析物捕獲可能是標準曲線不良的原因。除了校準曲線外，還應使用陽性和陰性對照樣品。陰性對照不應包含任何感興(xing) 趣分析物的痕跡，因為(wei) 它們(men) 用於(yu) 檢查假陽性和非特異性結合。陽性對照應含有已知濃度的目標分析物。如果測定檢測到陽性對照中存在分析物並且陰性對照均為(wei) 陰性，則測定工作可靠且結果有效。

使用已知濃度的校準品創建的 ELISA 標準曲線示例，X 表明通過曲線插值獲得的未知樣品的濃度。

培養箱和混合器

嚐試並使用 ELISA 的特定孵育時間和溫度，有助於(yu) 在捕獲抗體(ti) 和目標分析物之間達到結合平衡。控製板周圍溫度的一種方法是使用確保波動最小的培養(yang) 箱。此外，使用混合器可以幫助您的 ELISA 達到最佳性能，因為(wei) 它有助於(yu) 將試劑分布在整個(ge) 基質中，以促進更多的結合。一般來說，較長的潛伏期可能有利於(yu) 靈敏度，因為(wei) 有更多的時間進行結合。然而，還應該測試縮短的孵育時間。

捕獲抗體的固定化方法

當捕獲抗體(ti) 固定到 ELISA 板上時，其方向可能會(hui) 發生變化，從(cong) 而降低其親(qin) 和力以及與(yu) 抗原結合的機會(hui) 。此外，洗滌步驟中抗體(ti) 的置換可能導致靈敏度和重現性較差。解決(jue) 這個(ge) 問題的一種方法是使用單層表麵，使抗體(ti) 能夠共價(jia) 結合到板上，但 Tania García-Maceira 等人已經證明了靈敏度的更大改進。 （2020）通過使用甲殼素塗層的聚苯乙烯表麵來實現。使用這種固定形式，抗體(ti) 通過與(yu) 幾丁質結合域融合，以更好的方向被捕獲到微量滴定板上。