ozbiosesciences：CHAMP技術簡述

發展後脂轉染（基於(yu) 脂質的轉染方法）和磁轉染（基於(yu) 磁性納米顆粒的轉染方法），OZ Biosesciences 通過設計和合成新型陽離子羥基化雙親(qin) 多嵌段聚合物 (CHAMP) 改變了 Polyfection，該聚合物具有生物相容性、可裂解、 pH響應性和雙功能。

我們(men) 基於(yu) CHAMP技術創建了一種全新的轉染劑，以區別於(yu) 通常使用經典轉染方法進行的轉染劑。這種新型雙功能共聚物具有生物相容性、可電離性和 pH 敏感性。它由三個(ge) 部分組成，結合並引入了三個(ge) 協同概念：

• 由於(yu) 其電荷、pH 敏感和疏水特性， “穿過膜屏障"的概念。

• “隱形轉染"的理念是，DNA 一直受到保護、掩蔽和支持，直至被核吸收。

• 由於(yu) 可生物降解和可裂解部分而產(chan) 生的生物相容性概念

這種基於聚合物的轉染技術是一種優化的遞送係統，由於改進的遞送機製，可實現高效率和低細胞應激。

Helix-IN DNA 轉染試劑，我們的新型CHAMP聚合物，具有經典陽離子聚合物的所有特性，並通過核酸屏蔽核心增強，可降低細胞應激，並具有可生物降解的特性；這導致轉染增強。

原則

雙功能雙共聚物結構：DNA 包裝

這種新穎的CHAMP技術的特殊性來自於(yu) 雙功能陽離子生物聚合物由三個(ge) 部分組成，每個(ge) 部分具有不同的特性和功能。

• 聚合物附近的第一部分將 DNA 結合並高濃縮，並有助於(yu) 細胞質輸送。

• 第二個(ge) 成分是 pH 響應性且可裂解的連接體(ti) ，可通過促進內(nei) 體(ti) 膜不穩定來改善細胞遞送。

• 具有確定和優(you) 化分子量的第三部分充當 DNA 防護罩和核攝取促進劑。

每個(ge) 部分的分子量和長度（對於(yu) 每種類型的聚合物都是一定的）是與(yu) 整體(ti) 轉染效率相關(guan) 的重要參數。

螺旋-IN，我們的新型雙功能聚合物轉染試劑與其他病毒樣載體不同：DNA 在傳遞到細胞核之前對細胞是隱藏的。

它是如何工作的

1- 保護和血清穩定性

的設計螺旋-IN，我們(men) 的新型CHAMP聚合物允許 (1) 帶正電荷的聚合複合物在溶液中穩定，並且 (2) 不會(hui) 隨著時間的推移而聚集。

CHAMP 聚合物的結構、聚胺組成和接枝密度經過微調和優(you) 化，將聚合物複合物放置在溶解度不隨時間變化的精確界麵上。此外，親(qin) 水基團巧妙地排列在聚合物內(nei) ，以降低與(yu) 帶負電荷的血清蛋白（白蛋白……）的相互作用，從(cong) 而更有效地定義(yi) 基因載體(ti) 。

聚合體(ti) 保持完整，DNA 免受降解……

這種帶正電荷的雙功能聚合物具有增強的 DNA 結合特性，可在一定程度上保護 DNA； DNA/聚合物正電荷比使 DNA 與(yu) 聚合物結合，在保護核酸免遭血清酶降解方麵發揮關(guan) 鍵作用。我們(men) 設計了這種聚合物，即使在 50% 胎牛血清中 37°C 孵育 24 小時也不會(hui) 觀察到 DNA 降解。

2 - 細胞攝取

陽離子複合物主要通過靜電相互作用與(yu) 細胞膜結合（圖1-1），大多數複合物通過內(nei) 吞作用途徑（巨胞飲作用、吞噬作用、內(nei) 吞作用）被細胞吸收。文獻記載最多的內(nei) 吞途徑之一是由網格蛋白介導的（圖 1-2）。一旦被內(nei) 吞，複合物就會(hui) 內(nei) 化到早期內(nei) 涵體(ti) 中，其中 pH 值從(cong) 7.4（細胞表麵）降至 6.0（內(nei) 涵體(ti) 腔）。隨著內(nei) 體(ti) 進入晚期階段，pH 將降至 5。

圖 1. 多聚複合物的細胞內運輸。聚合複合物表麵過量的聚陽離子可以附著在細胞表麵 (1) 並被靶細胞攝取或內化，通常通過胞吞作用 (2)。一旦進入內體囊泡 (3)，質子-海綿聚合物的更高程度的質子化會導致離子流入，並且 pH 響應連接體被裂解，釋放出第一個聚合物單元（藍色）。接頭疏水域的暴露有利於滲透壓的增加，從而導致囊泡膨脹和破裂 (4)。第三個單元（紅色）仍然與核酸結合，從而降低細胞對 DNA 的感知，並通過直接導入細胞核 (5a) 或通過微管運輸 (5b) 協助其核遞送。一旦進入細胞核 (6)，DNA 就會被表達。

3- 內體逃逸和 DNA 釋放

^{聚合複合物逃避內(nei) 體(ti) 並通過與(yu) “質子海綿"效應}相關(guan) 的陽離子聚合物緩衝(chong) 能力將其貨物釋放到細胞核中。

質子胺在酸性介質中充當弱堿，使內(nei) 涵體(ti) 內(nei) 的 pH 值不穩定：一旦進入內(nei) 涵體(ti) ，特定的 ATP 酶就會(hui) 產(chan) 生大量質子流入，並由聚合物緩衝(chong) （圖 1-3）。質子的大量持續流動伴隨著氯離子的被動進入，導致水的積累。結果，囊泡膨脹直至內(nei) 體(ti) 破裂，其內(nei) 容物被輸送到細胞質中（圖 1-4）。

第一個(ge) 聚合物嵌段起到這個(ge) 作用。此外，pH 響應性和可裂解的疏水部分增加了補充功能。事實上，在生理 pH 值下隱藏的連接體(ti) 在酸性 pH 值下會(hui) 暴露出來。這導致其裂解和疏水區暴露，從(cong) 而促進內(nei) 體(ti) 膜融合/不穩定。

在此階段，幾個(ge) 重要的陷阱可能會(hui) 損害轉染效率：

• DNA 逃離核內(nei) 體(ti) 的能力是轉染的主要限製之一

• 人們(men) 普遍認為(wei) ，DNA 一旦進入細胞質，必須迅速進入細胞核以避免細胞質降解

• 內(nei) 體(ti) （也在細胞表麵）中存在細胞傳(chuan) 感器，可以識別外來核酸並誘導抑製轉染的保護性反應

雙功能共聚物：在細胞內，壓縮 DNA 的第一個塊具有高緩衝能力，有利於內體膨脹，pH 響應性可裂解接頭促進膜不穩定並將隱形 DNA 釋放到細胞質中；第三塊保護並引導DNA進入細胞核。

有哪些應用？

Helix-IN ™ DNA轉染試劑

主要用途是用於(yu) 體(ti) 外和體(ti) 內(nei) 應用的 DNA 轉染。

CHAMP 技術增強了轉染效果：更多 DNA 進入細胞，DNA 以隱形模式傳(chuan) 送至細胞核，不會(hui) 對細胞產(chan) 生警報和壓力……該試劑非常適合優(you) 先貼壁的永生化細胞係，例如 HEK-293、NIH-3T3、CHO 、COS、HeLa、MCF7、MEF、RPE、C2C12….

它非常適合多種 DNA 的共轉染。

在體(ti) 內(nei) ，DNA 被濃縮並保護成小的聚合體(ti) ，限製免疫反應，並能夠在循環係統中導航直至交付。

協議是什麽？

該方案很簡單：根據細胞類型，使用 1:1 至 3:1 的比例（每 µg DNA 1 µL 至每 µg DNA 3 µL）將轉染試劑直接與(yu) DNA 混合。孵育 30 分鍾後，將複合物和加強劑添加到細胞上。

30 分鍾的孵育時間是該方案的基石，可實現 DNA 的壓縮和保護。

在納米顆粒/DNA 複合物自組裝過程中，等待至少 30 分鍾以使共聚物和 DNA 形成穩定的超分子納米顆粒至關(guan) 重要。由於(yu) 共聚物的多部分性質，形成和穩定複合物的時間比“簡單"聚合物稍長，“簡單"聚合物的複合物形成速度更快（10-20 分鍾）。

脂轉染和多轉染之間的主要區別是什麽？

脂轉染和聚合轉染（分別是基於(yu) 脂質和基於(yu) 聚合物的轉染）是兩(liang) 種使用合成載體(ti) 將核酸遞送到細胞中的轉染方法。