澱粉脫分支酶（DBE）測試盒

澱粉脫分支酶（DBE）測試盒

微量法100管/48樣

正式測定前務必取2-3個(ge) 預期差異較大的樣本做預測定

測定意義(yi)

DBE能夠專(zhuan) 一性地裂解支鏈澱粉的α-1，6糖苷鍵，產(chan) 生線性的葡萄糖鏈，在調整支鏈澱粉分子的鏈長方麵有重要的作用。

測定原理

采用3，5-二硝基水楊酸法測定DBE催化支鏈澱粉產(chan) 生的還原糖，通過測定還原糖含量的變化來計算DBE活性。

需自備的的儀(yi) 器和用品

可見分光光度計/酶標儀(yi) 、水浴鍋、台式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰、蒸餾水

試劑的組成和配製

提取液：液體(ti) 100mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體(ti) 15mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1支，4℃保存；臨(lin) 用前每支加入6mL試劑一，充分混勻後備用；用不完的試劑4℃保存；

試劑三：液體(ti) 12mL×1瓶，4℃保存；

試劑四：液體(ti) 35mL×1瓶，4℃保存。

粗酶液提取

按照組織質量（g）：提取液體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。15000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟

1、分光光度計或酶標儀(yi) 預熱30min以上，調節波長到540 nm，蒸餾水調零。

2、加樣表

混勻，37℃準確保溫2h

混勻，95℃水浴5min，取200uL至微量石英比色皿或96孔板中，540nm處讀取各管吸光值。ΔA=A測定-A對照。每個(ge) 測定管需設個(ge) 一個(ge) 對照管。

注意：可以在不同對照管中加入不同樣品的粗酶液，然後集中進行5min 95℃沸水浴處理。

DBE活力單位的計算

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標準條件測定回歸方程為(wei) y = 3.8458x - 0.165；x為(wei) 標準品濃度（mg/mL），y為(wei) 吸光值。

（1）按照蛋白濃度計算

單位的定義(yi) ：每mg組織蛋白每h催化產(chan) 生1mg 葡萄糖定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

DBE活力(mg /min /mg prot)=[ (ΔA+0.165)÷3.8458×V反總]÷(V樣×Cpr)÷T

=0.26× (ΔA+0.165) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位的定義(yi) ：每g組織每分鍾催化產(chan) 生1mg 葡萄糖定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

DBE活力(mg /min /g鮮重)=[ (ΔA+0.165)÷3.8458×V反總]÷(W× V樣÷V樣總)÷T

=0.26× (ΔA+0.165) ÷W

V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，0.2mL； V樣：加入樣本體(ti) 積，0.1mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，1 mL；T：反應時間，2 h；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g。

b.用96孔板測定的計算公式如下

標準條件測定回歸方程為(wei) y = 1.9229x - 0.165；x為(wei) 標準品濃度（mg/mL），y為(wei) 吸光值。

（1）按照蛋白濃度計算

單位的定義(yi) ：每mg組織蛋白每h催化產(chan) 生1mg 葡萄糖定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

DBE活力(mg /min /mg prot)=[ (ΔA+0.165)÷1.9229×V反總]÷(V樣×Cpr)÷T

=0.52× (ΔA+0.165) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位的定義(yi) ：每g組織每分鍾催化產(chan) 生1mg 葡萄糖定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

DBE活力(mg /min /g鮮重)=[ (ΔA+0.165)÷1.9229×V反總]÷(W× V樣÷V樣總)÷T

=0.52× (ΔA+0.165) ÷W

V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，0.2mL； V樣：加入樣本體(ti) 積，0.1mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，1 mL；T：反應時間，2 h；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g。

標準曲線線性範圍為(wei) 0.1mg/mL-1mg/mL。

ΔA線性範圍為(wei) 0.01-1。

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