磷酸丙糖異構酶（TPI）測試盒

磷酸丙糖異構酶（TPI）測試盒

微量法100T/96S

注意：正式測定之前選擇2-3個(ge) 預期差異大的樣本做預測定。

測定意義(yi)

植物葉綠體(ti) 中磷酸丙糖異構酶是光合作用中參與(yu) calvin循環的重要酶。作用於(yu) 磷酸甘油醛和磷酸二羥丙酮之間的轉化，磷酸二羥丙酮能快速透過葉綠體(ti) 的包膜進入細胞質，並在其中逐步轉化為(wei) 蔗糖。

測定原理

磷酸丙糖異構酶將磷酸二羥丙酮轉化為(wei) 3-磷酸甘油醛，3-磷酸甘油醛與(yu) NAD在3-磷酸甘油醛脫氫酶的作用下生成3-磷酸甘油酸和NADH，340nm處的吸光度變化反映了磷酸丙糖異構酶的活性的高低。

自備實驗用品及儀(yi) 器

天平、低溫離心機、研缽、震蕩儀(yi) 、紫外分光光度計/酶標儀(yi) 、微量石英比色皿/96孔板。

試劑組成和配製  

提取液一：液體(ti) 100mL×1瓶，4℃保存。

提取液二：液體(ti) 100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體(ti) 12mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。臨(lin) 用前加2mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝後-20℃保存，禁止反複凍融。

試劑三：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。臨(lin) 用前加2 mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝後-20℃保存，禁止反複凍融。

試劑四：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。臨(lin) 用前加2 mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝後-20℃保存，禁止反複凍融。

酶液提取

①總TPI酶提取：建議稱取約0.1g樣本，加入1mL提取液一，冰浴勻漿後超聲破碎（冰浴，200W，破碎3s，間歇7s，總時間1min），然後4℃，8000g離心10min，取上清測定。

②胞漿和葉綠體(ti) TPI酶的分離：按照植物組織質量（g）：提取液體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5～10的比例（建議稱取約0.1g樣本，加入1mL提取液一），冰浴勻漿後於(yu) 4℃，200g離心5min，棄沉澱，取上清在4℃，8000g離心10min，取上清用於(yu) 測定胞漿TPI酶活性，取沉澱加1mL提取液二，震蕩溶解後超聲破碎（冰浴，200W，破碎3s，間歇7s，總時間1min），然後4℃，8000g離心10min，取上清測定葉綠體(ti) 中TPI酶活性。

建議測定總TPI酶活性，按照步驟①提取粗酶液，若需要分別測定胞漿和葉綠體(ti) 中的TPI，則按照步驟②提取粗酶液。

測定操作

1. 分光光度計/酶標儀(yi) 預熱30min，調節波長至340nm，蒸餾水調零。

2. 取微量石英比色皿/96孔板，依次加入120μL試劑一，20μL試劑二，20μL試劑三，20μL試劑四，20μL粗酶液，充分混勻，記錄340nm處10s的吸光值A1和310s的吸光值A2，△A=A2-A1

計算公式

1. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按照樣本蛋白濃度計算

酶活單位定義(yi) ：每毫克組織蛋白每分鍾生成1 nmol的NADH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

TPI（nmol/min/mg prot）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

（2）按照樣本質量計算

酶活單位定義(yi) ：每克組織每分鍾生成1 nmol的NADH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

TPI（nmol/min/g 鮮重）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=321.54×ΔA÷W

V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，0.2mL；ε：NADH摩爾消光係數，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體(ti) 積，0.02mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，1mL；T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g

2. 用96孔板測定的計算公式如下

（1）按照樣本蛋白濃度計算

酶活單位定義(yi) ：每毫克組織蛋白每分鍾生成1 nmol的NADH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

TPI（nmol/min/mg prot）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T= 643.08×ΔA÷Cpr

（2）按照樣本質量計算

酶活單位定義(yi) ：每克組織每分鍾生成1 nmol的NADH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

TPI（nmol/min/g 鮮重）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T= 643.08×ΔA÷W

V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，0.2mL；ε：NADH摩爾消光係數，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體(ti) 積，0.02mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，1mL；T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g

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