糜蛋白酶測試盒

糜蛋白酶測試盒

微量法100T/96S

注意：正式測定之前選擇2-3個(ge) 預期差異大的樣本做預測定。

測定意義(yi) ：

糜蛋白酶，又稱胰凝乳蛋白酶，是胰腺分泌的一種蛋白水解酶，能迅速分解變性蛋白質。糜蛋白酶的功能與(yu) 胰蛋白酶相似，但是具有分解能力強、毒性低和不良反應小等優(you) 點。臨(lin) 床上糜蛋白酶用於(yu) 痰液稀化，對膿性和非膿性痰液均有效；也用於(yu) 創傷(shang) 或手術後傷(shang) 口愈合，如白內(nei) 障摘除。

測定原理：

糜蛋白酶催化ATEE水解，產(chan) 物在237 nm有特征光吸收；通過測定237 nm 光吸收增加速率，來計算糜蛋白酶活性。

自備儀(yi) 器和用品：

台式離心機、水浴鍋、可調式移液器、研缽、紫外分光光度計/酶標儀(yi) 、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、冰和蒸餾水。

試劑組成和配製：

試劑一：液體(ti) 100mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶，4℃避光保存。臨(lin) 用前加入20 mL蒸餾水充分溶解。

粗酶液提取：

組織樣品：按照組織質量（g）：試劑一體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）冰浴勻漿，8000g，4℃離心10min，取上清，即粗酶液。

測定步驟：

1. 分光光度計/酶標儀(yi) 預熱30min，調節波長到237 nm，蒸餾水調零。

2. 試劑二置於(yu) 37℃水浴中保溫30min。

3. 空白管：取微量石英比色皿/96孔板，加入20μL試劑一，200μL試劑二，混勻於(yu) 237nm測定4min內(nei) 吸光值變化，記為(wei) △A空白管。（從(cong) 吸光值穩定增加開始計時）

4. 測定管：取微量石英比色皿/96孔板，加入20μL粗酶液，200μL試劑二，混勻於(yu) 237nm測定4min內(nei) 吸光值變化，記為(wei) △A測定管。（從(cong) 吸光值穩定增加開始計時）

注意：空白管隻需要測定一次。

糜蛋白酶活性計算公式：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按蛋白濃度計算

活性單位定義(yi) ：25℃每毫克蛋白每分鍾催化吸光值增加1為(wei) 一個(ge) 酶活單位。

糜蛋白酶（U/mg prot）= (△A測定管－△A空白管) ×V反總÷(Cpr×V1)÷T

=2.75×(△A測定管－△A空白管)÷Cpr

（2）按樣本質量計算

活性單位定義(yi) ：25℃每克樣品每分鍾催化吸光值增加1為(wei) 一個(ge) 酶活單位。

糜蛋白酶（U/g 鮮重）=(△A測定管－△A空白管) ×V反總÷(W×V1÷V2)÷T

=2.75×(△A測定管－△A空白管)÷W

W：樣品質量（g）；Cpr：粗酶液蛋白質濃度（mg/mL），需要另外測定；V1：加入反應體(ti) 係中粗酶液體(ti) 積（mL），20μL=2×10-2 mL；V2：粗酶液總體(ti) 積（mL），1 mL；V反總：反應總體(ti) 積，220μL=0.22mL； T：反應時間（min），4min。

b.使用96孔板測定的計算公式如下

（1）按蛋白濃度計算

活性單位定義(yi) ：25℃每毫克蛋白每分鍾催化吸光值增加1為(wei) 一個(ge) 酶活單位。

糜蛋白酶（U/mg prot）= (△A測定管－△A空白管) ×V反總÷(Cpr×V1)÷T

=2.75×(△A測定管－△A空白管)÷Cpr

（2）按樣本質量計算

活性單位定義(yi) ：25℃每克樣品每分鍾催化吸光值增加1為(wei) 一個(ge) 酶活單位。

糜蛋白酶（U/g 鮮重）=(△A測定管－△A空白管) ×V反總÷(W×V1÷V2)÷T

=2.75×(△A測定管－△A空白管)÷W

W：樣品質量（g）；Cpr：粗酶液蛋白質濃度（mg/mL），需要另外測定；V1：加入反應體(ti) 係中粗酶液體(ti) 積（mL），20μL=2×10-2 mL；V2：粗酶液總體(ti) 積（mL），1 mL；V反總：反應總體(ti) 積，220μL=0.22mL； T：反應時間（min），4min。

注意事項：

臨(lin) 用前配製的試劑配置好後3天內(nei) 使用完畢。

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