線粒體呼吸鏈複合體Ⅰ/NADH輔酶Q還原酶測試盒

線粒體(ti) 呼吸鏈複合體(ti) Ⅰ/NADH輔酶Q還原酶測試盒

微量法 100管/96樣

正式測定前務必取2-3個(ge) 預期差異較大的樣本做預測定

測定意義(yi)

複合體(ti) Ⅰ（EC 1.6.5. 3）又稱NADH-CoQ 還原酶或NADH脫氫酶，廣泛存在於(yu) 動物、植物、微生物和培養(yang) 細胞的線粒體(ti) 中，是線粒體(ti) 內(nei) 膜中最大的蛋白複合物。該酶催化一對電子從(cong) NADH傳(chuan) 遞給CoQ，同時可使O2還原生成O2.-，是呼吸電子傳(chuan) 遞鏈上產(chan) 生O2.-的主要部位。測定該酶活性，不僅(jin) 可以反映呼吸電子傳(chuan) 遞鏈（ETC）狀態，而且可以反映活性氧（ROS）生成狀態。

測定原理

複合體(ti) Ⅰ能夠催化NADH脫氫生成NAD+，在340nm下測定NADH的氧化速率計算出該酶活性的大小。

需自備的儀(yi) 器和用品

紫外分光光度計/酶標儀(yi) 、台式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配製

試劑一：液體(ti) 100mL×1瓶，-20℃保存；

試劑二：液體(ti) 20mL×1瓶，-20℃保存；

試劑三：液體(ti) 1.5mL×1瓶，-20℃保存；

試劑四：液體(ti) 25mL×1瓶，-20℃保存；

試劑五：液體(ti) 1mL×1支，-20℃保存；

試劑六：粉劑×1支，-20℃保存，用時加入2mL蒸餾水；用不完的試劑分裝後-20℃保存，禁止反複凍融。

工作液的配製：臨(lin) 用前將試劑五轉移到試劑四中混合溶解；用不完的試劑分裝後-20℃保存，禁止反複凍融。

樣本的前處理：

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與(yu) 線粒體(ti) 蛋白的分離：

• 準確稱取0.1g組織或收集500萬(wan) 細胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

• 將勻漿600g，4℃離心5min。

• 棄沉澱，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。

• 上清液即為(wei) 除去線粒體(ti) 的胞漿蛋白，可用於(yu) 測定從(cong) 線粒體(ti) 泄漏的複合體(ti) Ⅰ（此步可選做）。

• 步驟④中的沉澱即為(wei) 線粒體(ti) ，加入200uL試劑二和2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10秒，重複30次），用於(yu) 複合體(ti) Ⅰ酶活性測定。

測定步驟：

1. 分光光度計或酶標儀(yi) 預熱30min以上，調節波長至340nm，蒸餾水調零。

2. 樣本測定

（1）工作液於(yu) 37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）孵育5min。

（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、200μL工作液和15μL試劑六，混勻，記錄340nm處初始吸光值A1和 2min後的吸光值A2，計算ΔA=A1-A2。

複合體(ti) Ⅰ活力單位的計算

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下：

（1）按蛋白濃度計算

單位的定義(yi) ：每mg組織蛋白每分鍾消耗1 nmol NADH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

複合體(ti) Ⅰ活力（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1808×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

（2） 按樣本鮮重計算

單位的定義(yi) ：每g組織每分鍾消耗1 nmol NADH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

複合體(ti) Ⅰ活力（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=365×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算

單位的定義(yi) ：每1萬(wan) 個(ge) 細菌或細胞每分鍾消耗1 nmol NADH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

複合體(ti) Ⅰ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.73×ΔA

V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，2.25×10-4 L；ε：NADH摩爾消光係數，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體(ti) 積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，0.202 mL；T：反應時間，2 min；W：樣本質量，g；500：細胞或細菌總數，500萬(wan) 。

b.使用96孔板測定的計算公式如下：

（1）按蛋白濃度計算

單位的定義(yi) ：每mg組織蛋白每分鍾消耗1 nmol NADH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

複合體(ti) Ⅰ活力（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=3616×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

（2） 按樣本鮮重計算

單位的定義(yi) ：每g組織每分鍾消耗1 nmol NADH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

複合體(ti) Ⅰ活力（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=730×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算

單位的定義(yi) ：每1萬(wan) 個(ge) 細菌或細胞每分鍾消耗1 nmol NADH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

複合體(ti) Ⅰ活力（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=1.46×ΔA

V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，2.25×10-4 L；ε：NADH摩爾消光係數，6.22×103 L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體(ti) 積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，0.202 mL；T：反應時間，2 min；W：樣本質量，g；500：細胞或細菌總數，500萬(wan) 。

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