線粒體呼吸鏈複合體Ⅴ/ATP合酶/三磷酸腺苷合酶測試盒

線粒體(ti) 呼吸鏈複合體(ti) Ⅴ/ATP合酶/三磷酸腺苷合酶測試盒

微量法 100管/48樣

正式測定前務必取2-3個(ge) 預期差異較大的樣本做預測定

測定意義(yi) ：

線粒體(ti) 複合體(ti) Ⅴ又稱F1F0-ATP合酶，廣泛存在於(yu) 動物、植物、微生物和培養(yang) 細胞的線粒體(ti) 中，由F1和F0兩(liang) 個(ge) 亞(ya) 單位組成。該酶利用呼吸鏈產(chan) 生的質子電化學梯度催化ATP合成，也可逆過程水解ATP。此外，複合體(ti) Ⅴ還存在於(yu) 葉綠體(ti) 、異養(yang) 菌和光合細菌中。複合體(ti) Ⅴ是線粒體(ti) 氧化磷酸化和葉綠體(ti) 光合磷酸化合成ATP的關(guan) 鍵酶。

測定原理：

複合體(ti) Ⅴ水解ATP產(chan) 生ADP和Pi，通過測定Pi增加速率來測定複合體(ti) Ⅴ活性。

需自備的儀(yi) 器和用品：

可見分光光度計/酶標儀(yi) 、台式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配製：

試劑一：100mL×1瓶，-20℃保存；

試劑二：80mL×1瓶，-20℃保存；

試劑三：2 mL×1瓶，-20℃保存；

試劑四：粉劑×1支，-20℃保存；臨(lin) 用前加入2mL蒸餾水，充分溶解備用，用不完的試劑仍-20℃保存;

試劑五：8mL×1瓶，4℃保存；

試劑六：粉劑×1瓶，4℃保存；臨(lin) 用前加入4mL蒸餾水，充分混勻；溶解後4℃保存一周；

試劑七：粉劑×1瓶, 4℃保存；臨(lin) 用前加入10mL蒸餾水，充分混勻；溶解後4℃保存一周；

試劑八：粉劑×1瓶, 4℃保存；臨(lin) 用前加入10mL蒸餾水，充分混勻；溶解後4℃保存一周；

試劑九：液體(ti) 10mL×1 瓶，室溫保存。

定磷試劑的配製：按H2O: 試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1 的比例配製，配好的定磷試劑應為(wei) 淺黃色。若無色則試劑失效，若是藍色則為(wei) 磷汙染（請根據需要，用多少配多少）。

注意：配試劑最好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷汙染。

樣本的前處理：

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與(yu) 線粒體(ti) 蛋白的分離：

• 準確稱取0.1g組織或收集500萬(wan) 細胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

• 將勻漿600g，4℃離心5min。

• 棄沉澱，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。

• 上清液即為(wei) 除去線粒體(ti) 的胞漿蛋白，可用於(yu) 測定從(cong) 線粒體(ti) 泄漏的複合體(ti) Ⅴ（此步可選做）。

• 步驟④中的沉澱即為(wei) 線粒體(ti) ，加入800uL試劑二和8uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10秒，重複30次），用於(yu) 複合體(ti) Ⅴ酶活性測定。

測定步驟：

1、酶促反應（在EP管中加入下列試劑）

混勻， 37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）準確水浴30min

混勻，4000g，25℃離心10min，取上清液

2、定磷(在EP管或96孔板中加入下列試劑）

混勻，室溫靜置10min後，在 660nm處讀取A測定管和A對照管，計算ΔA=A測定管-A對照管。每個(ge) 測定管設一個(ge) 對照管。

複合體(ti) Ⅴ活性計算：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下：

標準條件下測定的回歸方程為(wei) y = 1.274x + 0.004；x為(wei) 標準品濃度（mmol/L），y為(wei) A值。

1、組織中複合體(ti) Ⅴ活性的計算:

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義(yi) ：每mg組織蛋白每分鍾產(chan) 生1 nmol 無機磷定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活性單位。

複合體(ti) Ⅴ活性（nmol/min/mg prot）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反總×106]÷(V樣×Cpr) ÷T

=62.8× (ΔA-0.004) ÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

（2） 按樣本鮮重計算

單位的定義(yi) ：每g組織每分鍾產(chan) 生1 nmol 無機磷定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活性單位。

複合體(ti) Ⅴ活性（nmol/min /g 鮮重）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反總×106]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T =50.7× (ΔA-0.004) ÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算

單位的定義(yi) ：每1萬(wan) 個(ge) 細菌或細胞每分鍾產(chan) 生1 nmol 無機磷定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活性單位。

複合體(ti) Ⅴ活性（nmol/min /104 cell）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反總×106]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.101× (ΔA-0.004)

V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，1.2×10-4 L； V樣：加入樣本體(ti) 積，0.05 mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，0.808 mL；T：反應時間，30 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細胞或細菌總數，500萬(wan) 。

b.使用96孔板測定的計算公式如下：

標準條件下測定的回歸方程為(wei) y = 0.637x + 0.004；x為(wei) 標準品濃度（mmol/L），y為(wei) A值。

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義(yi) ：每mg組織蛋白每分鍾產(chan) 生1 nmol 無機磷定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活性單位。

複合體(ti) Ⅴ活性（nmol/min /mg prot）=[(ΔA-0.004) ÷0.637×V反總×106]÷(V樣×Cpr) ÷T

=125.6× (ΔA-0.004) ÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

（2） 按樣本鮮重計算

單位的定義(yi) ：每g組織每分鍾產(chan) 生1 nmol 無機磷定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活性單位。

複合體(ti) Ⅴ活性（nmol/min /g 鮮重）=[(ΔA-0.004)÷0.637×V反總×106]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T

=101.5× (ΔA-0.004) ÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算

單位的定義(yi) ：每1萬(wan) 個(ge) 細菌或細胞每分鍾產(chan) 生1 nmol 無機磷定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活性單位。

複合體(ti) Ⅴ活性（nmol/min /104 cell）=[(ΔA-0.004)÷0.637×V反總×106]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T

=0.203× (ΔA-0.004)

V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，1.2×10-4 L； V樣：加入樣本體(ti) 積，0.05 mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，0.808 mL；T：反應時間，30 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細胞或細菌總數，500萬(wan) 。

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