過氧化物酶（POD）測試盒

過氧化物酶（POD）測試盒

微量法 100管/96樣

正式測定前務必取2-3個(ge) 預期差異較大的樣本做預測定

測定意義(yi) ：

POD（EC 1.11.1.7）廣泛存在於(yu) 動物、植物、微生物和培養(yang) 細胞中，可催化過氧化氫氧化酚類和胺類化合物，具有消除過氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用。

測定原理：

POD催化H2O2氧化特定底物，在470nm有特征光吸收。

需自備的儀(yi) 器和用品：

可見分光光度計/酶標儀(yi) 、台式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水

試劑的組成：

提取液：液體(ti) 100mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體(ti) 25mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：液體(ti) 100μL×1支，4℃保存；

試劑三：液體(ti) 100μL×1支，4℃保存。

粗酶液提取：

1、細菌、細胞或組織樣品的製備：

細菌或培養(yang) 細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nei) ，離心後棄上清；按照細菌或細胞數量（104個(ge) ）：提取液體(ti) 積（mL）為(wei) 500~1000：1的比例（建議500萬(wan) 細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重複30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質量（g）：提取液體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1. 分光光度計或酶標儀(yi) 預熱30min以上，調節波長至470nm，蒸餾水調零。

2. 工作液的配製：臨(lin) 用前將試劑一、試劑二、試劑三按照2.6（mL）：1.5（μL）：1（μL）的比例混勻；在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）預熱10min以上；現配現用。

3. 在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本和190μL工作液，混勻，記錄470nm下1min時吸光值A1和2min後的吸光值A2。計算ΔA＝A2-A1。

注意：

如果ΔA小於(yu) 0.005，可將反應時間延長到5min。如果ΔA大於(yu) 0.5，可將樣本用提取液稀釋後測定，計算公式中乘以相應稀釋倍數。

POD活性計算：

用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、血清（漿）POD活性

單位定義(yi) ：每mL血清（漿）在每mL反應體(ti) 係中每分鍾A470變化0.01為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

計算公式：

POD（U/mL）=ΔA×V反總÷V樣÷0.01÷T =2000×ΔA

2、組織、細菌或細胞POD活性

(1) 按樣本蛋白濃度計算

單位定義(yi) ：每mg組織蛋白在每mL反應體(ti) 係中每分鍾A470變化0.01為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

POD（U/mg prot）＝ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.01÷T =2000×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位定義(yi) ：每g組織在每mL反應體(ti) 係中每分鍾A470變化0.01為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

POD（U/g 鮮重）＝ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.01÷T =2000×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算

單位定義(yi) ：每1萬(wan) 個(ge) 細菌或細胞在每mL反應體(ti) 係中每分鍾A470變化0.01為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

POD（U/104 cell）＝ΔA×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷0.01÷T =4×ΔA

V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，0.2mL； V樣：加入樣本體(ti) 積，0.01mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，1 mL；T：反應時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量；500：細菌或細胞總數，500萬(wan) 。

用96孔板測定的計算公式如下

1、血清（漿）POD活性

單位定義(yi) ：每mL血清（漿）在每mL反應體(ti) 係中每分鍾A470變化0.005為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

POD（U/mL）=ΔA×V反總÷V樣÷0.005÷T =4000×ΔA

2、組織、細菌或細胞POD活性

(1) 按樣本蛋白濃度計算

單位定義(yi) ：每mg組織蛋白在每mL反應體(ti) 係中每分鍾A470變化0.005為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

POD（U/mg prot）＝ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.005÷T =4000×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位定義(yi) ：每g組織在每mL反應體(ti) 係中每分鍾A470變化0.005為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

POD（U/g 鮮重）＝ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.005÷T =4000×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算

單位定義(yi) ：每1萬(wan) 個(ge) 細菌或細胞在每mL反應體(ti) 係中每分鍾A470變化0.005為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

POD（U/104 cell）＝ΔA×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷0.005÷T =8×ΔA

V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，0.2mL； V樣：加入樣本體(ti) 積，0.01mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，1 mL；T：反應時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量；500：細菌或細胞總數，500萬(wan) 。

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