輔酶ⅠNAD(H)含量測試盒

輔酶ⅠNAD(H)含量測試盒

微量法 100管/48樣

正式測定前務必取2-3個(ge) 預期差異較大的樣本做預測定

測定意義(yi)

輔酶ⅠNAD(H)廣泛存在於(yu) 動物、植物、微生物和培養(yang) 細胞中，NAD+是糖酵解（EMP）和三羧酸循環（TCA）的主要氫受體(ti) ，生成的NADH經呼吸電子鏈（ETC）傳(chuan) 遞把電子交給氧，在合成ATP的同時，形成大量的ROS，同時NADH再生為(wei) NAD+。糖、脂、蛋白質三大代謝物質分解中的氧化反應絕大部分通過這一體(ti) 係完成。NAD(H)含量和NADH/NAD+比值的高低可用於(yu) 評價(jia) 糖酵解和TCA循環的強弱。較高的NAD(H)及NADH/NAD+比值說明細胞呼吸耗氧量較高，處於(yu) 過氧化狀態。此外，NADH/NAD+比值升高也可抑製糖酵解和TCA循環。另外，NAD+降解產(chan) 物對細胞信號傳(chuan) 導、代謝和基因表達等具有重要的調控作用。

測定原理

分別用酸性和堿性提取液提取樣品中NAD+和NADH，NADH通過PMS的遞氫作用，還原氧化型噻唑藍（MTT）為(wei) 甲瓚，在570nm下檢測吸光值；而NAD+可被乙醇脫氫酶還原為(wei) NADH，進一步采用MTT還原法檢測。

需自備的儀(yi) 器和用品

酶標儀(yi) 、台式離心機、移液器、96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配製

酸性提取液：液體(ti) 50mL×1瓶，4℃保存；

堿性提取液：液體(ti) 50mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體(ti) 10 mL×1瓶，4℃保存； 

試劑二：液體(ti) 3 mL×1瓶，4℃保存；

試劑三：粉劑×1瓶，-20 ℃保存，用時加入3mL蒸餾水，混勻，用不完的試劑4℃保存一周；

試劑四：粉劑×1瓶，4 ℃保存，用時加入3mL蒸餾水，混勻，用不完的試劑4℃保存一周；

試劑五：液體(ti) 3.6mL×1瓶，4 ℃保存；

試劑六：液體(ti) 30mL×1瓶，4 ℃保存；

試劑七：液體(ti) 50mL×1瓶，4 ℃保存。

NAD+和NADH的提取

1 血清（漿）中NAD+和NADH的提取

NAD+的提取：按照血清（漿）體(ti) 積（mL）：酸性提取液體(ti) 積（mL）為(wei) 1：5~10的比例（建議取約0.1mL血清（漿），加入1mL酸性提取液），95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻後，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

NADH的提取：按照血清（漿）體(ti) 積（mL）：堿性提取液體(ti) 積（mL）為(wei) 1：5~10的比例（建議取約0.1mL血清（漿），加入1mL堿性提取液），95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻後，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2組織中NAD+和NADH的提取：

NAD+的提取：按照組織質量（g）：酸性提取液體(ti) 積（mL）為(wei) 1：5~10的比例（建議取約0.1g組織，加入1mL酸性提取液），冰浴研磨，95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻後，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

NADH的提取：按照組織質量（g）：堿性提取液體(ti) 積（mL）為(wei) 1：5~10的比例（建議取約0.1g組織，加入1mL堿性提取液），冰浴研磨，95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻後，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3 細胞或細菌中NAD+和NADH的提取：

NAD+的提取：先收集細胞或細菌到離心管內(nei) ，棄上清，按照細菌或細胞數量（104個(ge) ）：酸性提取液體(ti) 積（mL）為(wei) 500~1000：1的比例（建議500萬(wan) 細菌或細胞加入1mL酸性提取液），超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重複30次），95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻後，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

NADH的提取：先收集細胞或細菌到離心管內(nei) ，棄上清，按照細菌或細胞數量（104個(ge) ）：堿性提取液體(ti) 積（mL）為(wei) 500~1000：1的比例（建議500萬(wan) 細菌或細胞加入1mL堿性提取液），超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重複30次），95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻後，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1. 分光光度計或酶標儀(yi) 預熱30min以上，調節波長至570nm，蒸餾水調零。

2. 加樣表(在1.5mL棕色EP管中按下表依次加樣）：

充分混勻，靜置5min後，20000g，25℃離心5min，棄上清，沉澱中加入：

混勻，取200μL轉移至微量石英比色皿或96孔板中，570nm下讀取對照吸光值A1和測定管吸光值A2，計算△A=A2-A1。

注意事項

1、如果一次性測定樣本數較多，可將試劑一、二、三和四按比例配成混合液。

2、對照管和測定管的測定步驟的區別：對照管加完試劑一、二、三、四和五後必須馬上加試劑六；測定管加完試劑一、二、三、四和五後必須反應20min後再加試劑六。

3、反應過程中注意避光。

4、若NAD+測定中△A（A2-A1）≤0.0302，NADH測定中△A（A2-A1）≤0.0222，說明樣本中輔酶含量較低，已低於(yu) 檢測限，可做如下調整：（1）將測定管避光靜置時間20min延長到60min；（2）在提取階段增加取樣量，即取0.2g樣本或0.2mL樣本加入1mL提取液。

5、由於(yu) 每一個(ge) 測定管需要設一個(ge) 對照管，本試劑盒100管保證測48個(ge) NAD+或NADH.

NAD+和NADH含量的計算

• NAD+含量的計算

標準條件下的回歸曲線為(wei) y = 0.1475x + 0.0302，R2 = 0.9978；其中y為(wei) △A，x為(wei) NAD+濃度nmol/mL

1、血清（漿）中NAD+含量計算

NAD+含量(nmol/mL）=[(△A -0.0302）÷0.1475×V1) ]÷(V3×V1÷V2)=135.6×(△A -0.0302）

2、組織、細菌或細胞中NAD+含量計算

(1)按樣本蛋白濃度計算

NAD+ (nmol/mg prot）=[(△A -0.0302）÷0.1475×V1)]÷(V1×Cpr)= 6.8×(△A -0.0302）÷Cpr

(2)按樣本鮮重計算

NAD+ (nmol/g 鮮重）= [(△A -0.0302）÷0.1475×V1)]÷(W×V1÷V2)= 13.6×(△A -0.0302）÷W

 (3)按細菌或細胞密度計算

NAD+ (nmol/104 cell）=[(△A -0.0302）÷0.1475×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.027×(△A -0.0302）

• NADH含量的計算

標準條件下的回歸曲線為(wei) y = 0.1404x + 0.0222，R2 = 0.9976；其中y為(wei) △A，x為(wei) NADH濃度nmol/mL

1、血清（漿）中NADH含量計算

NADH含量(nmol/mL）= [ (△A -0.0222）÷0.1404×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 142.5×(△A -0.0222）

2、組織、細菌或細胞中NADH含量計算

(1)按樣本蛋白濃度計算

NADH (nmol/mg prot）= [ (△A -0.0222）÷0.1404×V1) ]÷(V1×Cpr)= 7.1×(△A -0.0222）÷Cpr

(2)按樣本鮮重計算

NADH (nmol/g 鮮重）=[(△A -0.0222）÷0.1404×V1) ]÷(W×V1÷V2)= 14.2×(△A -0.0222）÷W

(3)按細菌或細胞密度計算

NADH (nmol/104 cell）= [ (△A -0.0222）÷0.1404×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.028×(△A -0.0222）

V1：加入反應體(ti) 係中樣本體(ti) 積，0.02mL；V2：加入提取液體(ti) 積，2mL；V3：加入血清（漿）體(ti) 積：0.1mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL； W：樣本質量，g；500：細胞或細菌總數，500萬(wan) 。

注意：*低檢測限為(wei) 0.1nmol/mL或0.1nmol/g鮮重 或0.001nmol/mg prot

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