穀氨酰胺酶（GLS)測試盒

穀氨酰胺酶（GLS)測試盒

 微量法 100管/96樣

正式測定前務必取2-3個(ge) 預期差異較大的樣本做預測定

測定意義(yi) ：

GLS（EC 3.5.1.1）是酰胺基水解酶，催化天冬酰胺水解成穀氨酸和氨，在氮素代謝中具有重要調控作用，尤其是調節遊離氨含量和尿素代謝。

測定原理：

GLS催化穀氨酰胺水解成L-穀氨酸和氨，利用奈氏試劑檢測氨增加的速率，即可計算其酶活性。

需自備儀(yi) 器和用品：

台式離心機、酶標儀(yi) 、96孔板、可調式移液槍、研缽、冰和雙蒸水。

試劑組成和配製：

試劑一×2瓶，60 mL，4 ℃保存；

試劑二×1瓶，40 mL，4 ℃保存；

試劑三×1瓶，60 mL，常溫保存；

試劑四×1瓶，5 mL，常溫保存；

試劑五×1瓶，3 mL，常溫保存；

試劑六×1瓶，3 mL，常溫避光保存。

粗酶液提取：

1、細菌、細胞或組織樣品的製備：

細菌或培養(yang) 細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nei) ，離心後棄上清；按照細菌或細胞數量（104個(ge) ）：試劑一體(ti) 積（mL）為(wei) 500~1000：1的比例（建議500萬(wan) 細菌或細胞加入1mL試劑一），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重複30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質量（g）：試劑一體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、酶標儀(yi) 預熱30min以上，調節波長至420nm。

2、樣品測定（在EP管中加入下列試劑）：

混勻，37℃水浴1 小時

混勻，8000 g，25℃離心10 min；取上清液，在96孔板中加入下列試劑

混勻，室溫靜置15min，420nm處讀取測定管和對照管吸光值，計算ΔA=A測定管-A對照管。對照管隻要做一管。

注意：

1、試劑六如出現沉澱，靜置後取上清使用。

2、ΔA（A測定管-A對照管）若出現負值，可能是酶活性較低，可將反應時間1h延長到2h，相應的在計算公式中除以2。

酶活性計算：

標準條件下測定的回歸方程為(wei) y = 1.9244x + 0.0057，R2 = 0.9983；x為(wei) 標準品濃度（μmol/mL），y為(wei) 吸光值A。

1、血清（漿）GLS活性

單位定義(yi) ：每mL血清（漿）每min催化穀氨酰胺生成1nmol 氨定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。GLS(nmol /min /mL)＝ (ΔA-0.0057) ÷1.9244×V反總÷V樣÷T×1000=363.7×(ΔA -0.0057)

 2、組織、細菌或細胞GLS活性

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位定義(yi) ：每mg蛋白質每min催化穀氨酰胺生成1nmol 氨定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

GLS(nmol /min /mg prot)＝ (ΔA-0.0057) ÷1.9244×V反總÷(V樣×Cpr)÷T×1000=363.7×(ΔA -0.0057)÷Cpr。

（2）按樣本鮮重計算：

單位定義(yi) ：每g組織每min催化穀氨酰胺生成1nmol 氨定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

GLS(nmol/min /g 鮮重)＝(ΔA-0.0057)÷1.9244×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T×1000=363.7×(ΔA -0.0057)÷W。

（3）按細菌或細胞密度計算

單位定義(yi) ：每1萬(wan) 個(ge) 細菌或細胞每min催化穀氨酰胺生成1nmol 氨定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。GLS(nmol/min/104 cell)＝(ΔA-0.0057)÷1.9244×V反總÷(500×V樣÷V樣總) ÷T ×1000       =0.7274×(ΔA -0.0057)

V樣總：加入提取液體(ti) 積，1 mL；T：反應時間，60min；V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，1.05mL；V樣：加入反應體(ti) 係中樣本體(ti) 積，0.025mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500萬(wan) ; 1000，μmol到nmol換算係數。

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