脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）測試盒

脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）測試盒

微量法 100T/96S

注意：正式測定之前選擇2-3個(ge) 預期差異大的樣本做預測定。

測定意義(yi) ：

DHAR存在於(yu) 細胞質、線粒體(ti) 和葉綠體(ti) 中。DHAR催化GSH還原DHA生成AsA和GSSG，調控細胞AsA/DHA比值，是抗壞血酸-穀胱甘肽氧化還原循環的關(guan) 鍵酶。提高植物體(ti) 內(nei) 的 DHAR 活性，可提高植物食品中AsA含量，進而提高植物食品的營養(yang) 品質。

測定原理：

DHAR催化GSH還原DHA生成AsA，通過測定DHA減少速率，計算DHAR活性。

實驗中所需儀(yi) 器及設備：

研缽、冰、低溫離心機、紫外分光光度計/酶標儀(yi) 、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、可調式移液器和蒸餾水。

試劑組成和配製：

試劑一：液體(ti) 100mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體(ti) 17.5mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1瓶（棕色），4℃保存。臨(lin) 用前加入2.5 mL蒸餾水充分溶解。

試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存。臨(lin) 用前加入2.5 mL蒸餾水充分溶解。

粗酶液提取：

按照組織質量（g）：試劑一體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。

2. 細菌、真菌：按照細胞數量（104個(ge) ）：試劑一體(ti) 積（mL）為(wei) 500~1000：1的比例（建議500萬(wan) 細胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；8000g 4℃離心20min，取上清液置冰上混勻待測。

3.  血清等液體(ti) ：直接測定。

DHAR測定操作：

1. 分光光度計/酶標儀(yi) 預熱30 min，調節波長到265nm，蒸餾水調零。

2. 試劑二在25℃水浴鍋中預熱30 min。

3. 在微量石英比色皿/96孔板中依次加入20μL試劑三、20μL試劑四和140μL 試劑二，最後加20μL上清液迅速混勻後於(yu) 265nm比色，記錄30s和150s的吸光值A1和A2，△A=A2-A1。

DHAR活性計算公式：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義(yi) ：25℃中每毫克蛋白每分鍾還原生成1nmol AsA 為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

DHAR(nmol/min/mg prot) = △A÷ε÷d×V反總×109÷(Cpr×V樣)÷T

= 92×△A ÷Cpr

(2). 按樣本質量計算

活性單位定義(yi) ：25℃中每克樣本每分鍾還原生成1nmol AsA 為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

DHAR(nmol/min/g 鮮重) = △A÷ε÷d×V反總×109÷(W×V樣÷V樣總)÷T

= 92×△A ÷W

(3). 按細胞數量計算

活性單位定義(yi) ：25℃中每104個(ge) 細胞每分鍾還原生成1nmol AsA 為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

DHAR(nmol/min/104 cell) = △A÷ε÷d×V反總×109÷(細胞數量×V樣÷V樣總)÷T

= 92×△A ÷細胞數量

（4）按液體(ti) 體(ti) 積計算

活性單位定義(yi) ：25℃中每毫升樣本每分鍾還原生成1nmol AsA 為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

DHAR(nmol/min/mL) = △A÷ε÷d×V反總×109÷V樣÷T

= 92×△A

ε ：AsA在265nm處摩爾吸光係數為(wei) 5.42×104 L/mol /cm；106：摩爾分子換算成微摩爾分子；d：比色杯光徑，1cm；V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，0.2mL=2×10-4 L；V樣：反應體(ti) 係中加入上清液體(ti) 積，20μL =0.02mL；V樣總：提取液體(ti) 積，1 mL；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL；W ：樣品質量；T：反應時間，2 min。

b.使用96孔板測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義(yi) ：25℃中每毫克蛋白每分鍾還原生成1nmol AsA 為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

DHAR(nmol/min/mg prot) = △A÷ε÷d×V反總×109÷(Cpr×V樣)÷T

= 184×△A ÷Cpr

(2). 按樣本質量計算

活性單位定義(yi) ：25℃中每克樣本每分鍾還原生成1nmol AsA 為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

DHAR(nmol/min/g 鮮重) = △A÷ε÷d×V反總×109÷(W×V樣÷V樣總)÷T

= 184×△A ÷W

(3). 按細胞數量計算

活性單位定義(yi) ：25℃中每104個(ge) 細胞每分鍾還原生成1nmol AsA 為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

DHAR(nmol/min/104 cell) = △A÷ε÷d×V反總×109÷(細胞數量×V樣÷V樣總)÷T

= 184×△A ÷細胞數量

（4）按液體(ti) 體(ti) 積計算

活性單位定義(yi) ：25℃中每毫升樣本每分鍾還原生成1nmol AsA 為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

DHAR(nmol/min/mL) = △A÷ε÷d×V反總×109÷V樣÷T

= 184×△A

ε ：AsA在265nm處摩爾吸光係數為(wei) 5.42×104 L/mol /cm；106：摩爾分子換算成微摩爾分子；d：96孔板光徑，0.5 cm；V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，0.2mL=2×10-4 L；V樣：反應體(ti) 係中加入上清液體(ti) 積，20μL =0.02mL；V樣總：提取液體(ti) 積，1 mL；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL；W ：樣品質量；T：反應時間，2 min。

注意事項：

臨(lin) 用前配製的試劑未使用完的4℃保存，3天內(nei) 使用完。

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