羥脯氨酸（HYP）測試盒

羥脯氨酸（HYP）測試盒  

微量法100T/96S

注意：正式測定之前選擇2-3個(ge) 預期差異大的樣本做預測定。

測定意義(yi) ：

HYP是機體(ti) 膠原蛋白主要成分之一，膠原蛋白大多分布於(yu) 皮膚、腱、軟骨和血管等，因此HYP含量是反映膠原組織代謝及纖維化程度的一項重要指標。

測定原理：

樣品經水解產(chan) 生遊離的HYP，進一步被氯胺T氧化，氧化產(chan) 物與(yu) 對二甲氨基苯甲醛反應，產(chan) 生紅色化合物，在560nm處有特征吸收峰。通過測定樣品水解液560nm吸光值，可計算HYP含量。

自備實驗用品及儀(yi) 器：

天平、烘箱、玻璃管、離心機、水浴鍋、可見分光光度計/酶標儀(yi) 、微量石英比色皿/96孔板、無水乙醇、異丙醇、6mol/L鹽酸和蒸餾水。

試劑組成和配製：

組織提取液：6mol/L鹽酸，自備。濃鹽酸：H2O（V/V）= 1:1，室溫保存。

細胞提取液：液體(ti) 100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體(ti) 6mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑二：液體(ti) 6mL×1瓶，4℃避光保存。

羥脯氨酸提取：

1. 組織：稱取約0.2g樣品於(yu) 玻璃管，加入2mL的組織提取液，置於(yu) 110℃烘箱，水解6至12小時，用提取液定容至2mL，12000g，25℃，離心20min，取上清待測。

2. 細胞：取約500萬(wan) 個(ge) 細胞，加入1mL的細胞提取液，於(yu) 高壓消毒器中15磅保持30min，自然降壓後待測。

3. 血清遊離羥脯氨酸提取：取0.1mL血清，加入0.5mL無水乙醇使蛋白質沉澱，8000g4℃離心5min。將上清倒入另一個(ge) EP管，氮吹或沸水浴將乙醇揮發幹。冷卻後再加入0.2mL50%異丙醇，充分溶解混勻待測。

測定操作表：

1. 分光光度計/酶標儀(yi) 預熱30min，調節波長至560nm，蒸餾水調零。

2. 操作表

羥脯氨酸含量計算公式：

1. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標準曲線：y=64.875x+ 0.0251，R2=0.9991

（1）按樣品重量計算

組織羥脯氨酸含量（mg/g 鮮重）=（ΔA-0.0251）÷64.875×V反總÷(V樣÷V樣總×W)

                        = 0.154×（ΔA-0.0251）÷W

（2）按細菌或細胞密度計算

細胞羥脯氨酸含量（mg/104 cell）=（ΔA-0.0251）÷64.875×V反總÷V樣×V樣總÷細胞數量（萬(wan) 個(ge) ）= 0.077×（ΔA-0.0251）÷ 細胞數量（萬(wan) 個(ge) ）

（3）按血清體(ti) 積計算

HYP含量（mg/mL）=（ΔA-0.0251）÷ 64.875×V反總÷V樣×2

                 =0.154×（ΔA-0.0251）

V反總：反應總體(ti) 積，0.3 mL；V樣：反應中樣品體(ti) 積，0.06mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積， mL；W：樣本重量，g

b.用96孔板測定的計算公式如下

標準曲線：y=32.4375x+ 0.0251，R2=0.9991

（1）按樣品重量計算

HYP含量（mg/g 鮮重）=（ΔA-0.0251）÷32.4375×V反總÷(V樣÷V樣總×W)

                = 0.308×（ΔA-0.0251）÷W

（2）按細菌或細胞密度計算

HYP含量（mg/104 cell）=（ΔA-0.0251）÷32.4375×V反總÷V樣×V樣總÷細胞數量（萬(wan) 個(ge) ）= 0.154×（ΔA-0.0251）÷細胞數量（萬(wan) 個(ge) ）

（3）按血清體(ti) 積計算

HYP含量（mg/mL）=（ΔA-0.0251）÷32.4375×V反總÷V樣×2

                 = 0.308×（ΔA-0.0251）

V反總：反應總體(ti) 積，0.3 mL；V樣：反應中樣品體(ti) 積，0.06mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積， mL；W：樣本重量，g；2，血清吹幹後複溶的倍數。

注意事項：

1. 吸光值大於(yu) 0.8，樣品適當稀釋再測定，注意計算公式裏乘以稀釋倍數。

2. 試劑有一定的毒性，請操作時做好防護措施，防止吸入或與(yu) 皮膚接觸。

3. *低檢出限為(wei) 3.8mg/L。

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