海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)測試盒

海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)測試盒

分光光度法 50 管/48 樣

正式測定前務必取 2-3 個(ge) 預期差異較大的樣本做預測定

測定意義(yi) ：

海藻糖是由兩(liang) 個(ge) 葡萄糖分子以α ,  α- 1- 1  糖苷鍵連接而成的一種非還原雙糖， 廣泛存  在於(yu) 細菌、酵母菌、黴菌、食用菌、低等植物、昆蟲、 無脊椎動物和高等植物等多種有機體(ti) 中。海藻糖的非還原性決(jue) 定了它對酸、堿、高溫等的穩定性。另外， 它本身具有很強的吸水 性，使它在生物體(ti) 內(nei) 具有抗脫水作用，在逆境條件下可通過識別外界刺激、產(chan) 生和傳(chuan) 遞信號、 基因表達和代謝調節來保護植物免受不良環境的傷(shang) 害。

植物體(ti) 內(nei) 主要以葡萄糖為(wei) 底物合成海藻糖，該反應首先在海藻糖-6-磷酸合成酶

（trehalose-6-phosphate synthase ，TPS）的作用下，催化尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）和 6- 磷酸葡萄糖反應生成中間產(chan) 物6-磷酸海藻糖， 再在海藻糖-6-磷酸磷酸酶 （trehalose

6-phosphate phosphatase ，TPP）的作用下去磷酸化，生成海藻糖。因此，測定TPS活性對於(yu)

研究植物逆境具有重要意義(yi) 。

測定原理：

TPS 催化 UDPG 與(yu)  G6P 生成海藻糖-6-磷酸，同時產(chan) 生 UDP；UDP 在丙酮酸激酶與(yu) 乳 酸脫氫酶作用下，氧化 NADH 為(wei)  NAD+，NADH 的下降速率與(yu)  UDP 含量成正比，通過 340nm 吸光度下降速率反映 TPS 活性。

需自備的儀(yi) 器和用品：

分光光度計、水浴鍋、可調式移液器、1mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配製：

提取液：液體(ti)  100mL×1 瓶， 4℃保存；

試劑一：粉劑×1 瓶， -20℃保存； 臨(lin) 用前加入 10mL 試劑五溶解，用不完的試劑分裝後-20℃ 保存，禁止反複凍融；

試劑二：粉劑×2 瓶， -20℃保存；臨(lin) 用前每瓶加入 25mL 試劑五溶解；現配現用；

試劑三：粉劑× 1 瓶， -20℃避光保存；臨(lin) 用前加入 0.1mL 試劑五溶解，用不完的試劑分裝後 -20℃保存，禁止反複凍融；

試劑四：100μL×1 瓶， 4℃避光保存；臨(lin) 用前低速離心，以防止試劑沾在管壁；

試劑五：液體(ti)  100mL× 1 瓶，4℃保存；

工作液的配製： 臨(lin) 用前， 先配置好 1 瓶試劑二和試劑三， 然後在試劑二瓶中加入 25μL 試劑 三和 25μL 試劑四， 充分混勻，現配現用。

樣品測定的準備：

1、細菌或細胞的處理：收集細菌或細胞到離心管內(nei) ，離心後棄上清；按照細菌或細胞數量 （104 個(ge) ）： 提取液體(ti) 積（mL）為(wei) 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wan) 細菌或細胞加入 1mL 提取液）， 超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3S，間隔 10S，重複 30 次） ；8000g ，4℃離心 10min，取上清， 置冰上待測。

2、組織的處理： 按照組織質量（g）：提取液體(ti) 積(mL)為(wei)  1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液） ，冰浴中勻漿。 8000g  

4℃離心 10min，取上清， 置冰上待測。 測定步驟

1 、在 EP 管中加入如下試劑

混勻， 30℃反應 20min ，95℃水浴 2min 滅活， 冷卻至室溫。10000g 4℃離心 5min，取上層 反應液待測。
2、工作液配製： 詳見試劑的組成和配製中工作液的配製。
3、在 1mL 玻璃比色皿中加入如下試劑

混勻，測定 340nm 下 5min 後吸光值 A1 與(yu) 10min 後吸光值 A2 ，ΔA=A1-A2。
TPS 活力計算：
1、按照蛋白濃度計算
單位的定義(yi) ：每 mg 組織蛋白每分鍾催化 1nmol NADH 定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。
TPS 活力(nmol/min/mg prot)=ΔA×V 反總÷  ( ε×d）×109÷（V 樣×Cpr）÷T×3
=643×ΔA ÷Cpr
2、按樣本鮮重計算
單位的定義(yi) ：每 g 組織每分鍾催化 1nmol NADH 定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。
TPS 活力(nmol/min/g  鮮重)=ΔA×V 反總÷  ( ε×d）×109÷（W× V 樣÷V 樣總） ÷T×3
=643×ΔA÷W
3、按細菌或細胞密度計算
單位的定義(yi) ：每 1 萬(wan) 個(ge) 細菌或細胞每分鍾催化 1nmol NADH 定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。
TPS 活力(nmol/min/104  cell)=ΔA×V 反總÷  ( ε×d）×109÷（V 樣×細胞數量）÷T×3
= 1.28×ΔA
V  反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，1mL；ε：NADH 摩爾消光係數， 6.22×103  L / mol /cm；d：比色 皿光徑， 1cm；V 樣：加入樣本體(ti) 積， 0.15 mL；V 樣總：加入提取液體(ti) 積， 1 mL；T：反應 時間， 5  min；3，稀釋倍數；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量；細胞數量， 500 萬(wan) 。

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