抗壞血酸過氧化物酶（APX）測試盒

抗壞血酸過氧化物酶（APX）測試盒

 微量法 100T/96S

注意：正式測定之前選擇2-3個(ge) 預期差異大的樣本做預測定。

測定意義(yi) ：

APX是植物清除活性氧的重要抗氧化酶之一，也是抗壞血酸代謝的關(guan) 鍵酶之一。APX具有多種同功酶，分別定位於(yu) 葉綠體(ti) 、胞質、線粒體(ti) 、過氧化物和乙醛酸體(ti) ，以及過氧化體(ti) 和類囊體(ti) 膜上。APX 催化H2O2氧化AsA，是植 AsA 的主要消耗者。APX的活性直接影響到AsA的含量，APX與(yu) AsA具有一定的負相關(guan) 性。

測定原理：

APX 催化H2O2氧化AsA，通過測定AsA氧化速率，來計算得APX活性。

自備儀(yi) 器用品：

低溫離心機、紫外分光光度計/酶標儀(yi) 、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、移液槍、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配製：

試劑一：液體(ti) 120mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。臨(lin) 用前加3 mL蒸餾水充分溶解。

試劑三：液體(ti) 3mL×1支，4℃保存。

粗酶液提取：

按照組織質量（g）：試劑一體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。13000g，4℃離心20min，取上清置冰上待測。

測定：

1. 分光光度計/酶標儀(yi) 預熱30 min以上，調節波長到290nm，用蒸餾水調零。

2. 試劑一在25℃中預熱30min。

3.依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、140μL預熱的試劑一20μL試劑二和20μL試劑三，迅速混勻後在290nm測定10s和130s光吸收A1和A2，△A=A1-A2。

APX活性計算：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

(1)  按樣本蛋白濃度計算

活性單位定義(yi) ：每毫克蛋白每分鍾氧化1nmol AsA 為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

APX(nmol/min/mg prot) = △A÷(ε×d）×V反總×109÷(Cpr×V樣)÷T

=1786×△A÷ Cpr

（2）按樣本質量計算

活性單位定義(yi) ：每g組織每分鍾氧化1nmol AsA 為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

APX(nmol/min/g 鮮重 ) = △A÷(ε×d）×V反總×109÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=1786×△A ÷W

ε：AsA在290nm處摩爾吸光係數為(wei) 2.8×103 L/mol/cm；d：比色皿光徑（cm），1 cm；V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積（L），200μL=2×10-4 L；109：1mol=1×109nmol；Cpr：上清液蛋白質濃度（mg/mL），需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒；W ：樣品質量；V樣：加入反應體(ti) 係中上清液體(ti) 積（mL），20μL=0.02mL；V樣總：提取液體(ti) 積，1 mL；T：催化反應時間（min），2min。

b.使用96孔板測定的計算公式如下

(1)  按樣本蛋白濃度計算

活性單位定義(yi) ：每毫克蛋白每分鍾氧化1nmol AsA 為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

APX(nmol/min/mg prot) = △A÷(ε×d）×V反總×109÷(Cpr×V樣)÷T

=3571×△A÷ Cpr

（2）按樣本質量計算

活性單位定義(yi) ：每g組織每分鍾氧化1nmol AsA 為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

APX(nmol/min/g 鮮重) = △A÷(ε×d）×V反總×109÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=3571×△A ÷W

ε：AsA在290nm處摩爾吸光係數為(wei) 2.8×103 L/mol/cm；d：96孔板光徑（cm），0.5 cm；V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積（L），200μL=2×10-4 L；109：1mol=1×109nmol；Cpr：上清液蛋白質濃度（mg/mL），需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒；W ：樣品質量；V樣：加入反應體(ti) 係中上清液體(ti) 積（mL），20μL=0.02mL；V樣總：提取液體(ti) 積，1 mL；T：催化反應時間（min），2min。

注意事項：

配製好的試劑二4℃保存，並且3天內(nei) 使用完。

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